Technique à la cible microinjection du Developing<em> Xenopus</em> Kidney

Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l'extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros ^1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L'unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse ^{2, 3.} Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , ^{1, 4-6} (figure 1 </strong>). Le seul grand néphrons présent dans les pronéphros Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l'étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie.

Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase ^7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro – injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d' autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l'ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente ^12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l'injection avec morpholinos pour abattre l'expression des gènes, ou avec de l'ARN exogène pour surexprimer un gène d'intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l'embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d'un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l'embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l'embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l'indice pronephrique ^13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d'un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l'analyse.

Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle ^14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 – 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l'étape 1 (1 cellule) à l'étape 3 (4 cellules) est d'environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l'étape 3 est d'environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d'un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu'à ce que le rein a pleinement développé.

L'épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu ^15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible ^16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l' étape 38 – 40 embryons qui permettent d'évaluer le développement pronephrique après manipulation de l' expression du gène ciblé dans les embryons de xénope ^18-20.