Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em> Xenopus</em> Kidney

De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo's ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros ^1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoogdieren en amfibieën vereisen dezelfde signaling cascades en inductieve evenementen om nefrogenese ^{2, 3} ondergaan. De Xenopus pronephros bevat één nefron bestaat uit proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden, en een glomus (analoog aan het zoogdier glomerulus) ^{1, 4-6} (figuur 1 </strong>). De enkele, grote nefron in de Xenopus pronephros maakt het geschikt als een eenvoudig model voor de studie van genen betrokken bij nier- ontwikkeling en ziekteprocessen.

Lot van de cel kaarten zijn vastgesteld voor de vroege Xenopus embryo's, en zijn vrij bij Xenbase ^11/7 online beschikbaar. We beschrijven een techniek voor micro-injectie van lineage tracers voor de ontwikkeling Xenopus pronephros gericht, hoewel dezelfde techniek kan worden aangepast aan andere weefsels zoals het hart of ogen targeten. Lineage tracers zijn labels (zoals vitale kleurstoffen, fluorescent gelabelde dextranen, histochemisch detecteerbare enzymen en mRNA coderend fluorescerende eiwitten) die kan worden geïnjecteerd in een vroeg blastomeer, waardoor de visualisatie van de nakomelingen van die cel tijdens de ontwikkeling. Dit protocol maakt gebruik van MEM-RFP mRNA coderend membraan gerichte rood fluorescerend eiwit ^12, een lijn tracer. De beoogde micro-injectie technieken voor individuele blastomeren in de 4- en 8-cellige embryo beschreven kunnen worden gebruikt voor injectie met morpholinos te breken genexpressie, of exogene RNA een gen van belang tot overexpressie. Door injecteren in de ventrale, vegetale blastomeer, vooral de pronephros van het embryo zal gericht, waardoor de contralaterale pronephros als ontwikkelings controle. Co-injectie van een tracer controleert of de juiste blastomere werd geïnjecteerd, en laat zien welke weefsels in het embryo is ontstaan ​​uit de geïnjecteerde blastomere, het verifiëren van de gerichtheid van de pronephros. Immunokleuring van de pronephros maakt visualisatie van hoe goed de pronephric buisjes zijn gericht. Overexpressie en knockdown effecten kunnen dan worden gemaakt tegen de contralaterale zijde van het embryo, die als ontwikkelings- controle en kan worden gebruikt om de pronephric index ¹³ berekend. De beschikbaarheid die het lot maps toelaat gerichte micro-injectie technieken worden gebruikt om weefsels oth targetener dan pronephros en co-injectie van een fluorescente tracer kan de gerichte micro-injectie op elk weefsel vóór de analyse worden geverifieerd.

Tijdens embryo micro-injectie, dient ontwikkelings temperatuur strak gereguleerd, omdat de snelheid van Xenopus ontwikkeling sterk afhankelijk is ^14. Embryo's worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (14-16 ° C) voor de 4- en 8-cell injecties omdat de ontwikkeltijd wordt vertraagd. Bij 22 ° C, ontwikkeltijd uit stap 1 (1 cel) naar fase 3 (4 cellen) ongeveer 2 uur, terwijl bij 16 ° C ontwikkelingstijd naar fase 3 ongeveer 4 uur. Het duurt ongeveer 15 minuten om een ​​4-cel embryo een 8-cel (stap 4) embryo bij 22 ° C, maar duurt ongeveer 30 minuten bij 16 ° C. Evenzo, bij 22 ° C duurt slechts 30 minuten voor een 8-cellige embryo op weg naar een 16-cel embryo (stap 5). Ditmaal echter 45 minuten bij 16 ° C. Dewaardo or, is het nuttig om langzaam de ontwikkelingssnelheid van de embryo voldoende voor injecties in het 8-cellig stadium schakelen voordat de embryo's ontwikkelen tot het 16-cellig stadium. Bovendien kan groeitemperatuur gemoduleerd versnellen of vertragen van embryonale ontwikkeling tot de nier volledig is ontwikkeld.

De epidermis van kikkervisje stadium Xenopus embryo's is relatief transparant, zorgen voor gemakkelijke beeldvorming van de ontwikkelingslanden pronephros zonder dissectie of clearing van het weefsel ^15. Door de relatieve transparantie van embryonale ontwikkeling, live cell imaging is ook mogelijk ^16,17. Whole-mount immunokleuring aan de pronephros visualiseren is mogelijk met gevestigde antilichamen die de proximale, tussengelegen, distale en het aansluiten van buisjes van het podium 38 labelen – 40 embryo's die het mogelijk maken voor de beoordeling van pronephric ontwikkeling na gerichte manipulatie van genexpressie in Xenopus embryo's ^18-20.