開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em>アフリカツメガエル</em>腎臓

アフリカツメガエル胚腎臓、前腎は、腎臓の開発と疾患を研究するための優れたモデルです。胚は、外部開発サイズが大きく、大量に製造することができ、かつ容易に微量注入または外科的処置を介して操作されます。また、哺乳類や両生類における腎臓発生を支配する遺伝子が保存されています。胚両生類は前腎を持っており、大人の両生類は後腎を持っていながら、前腎、中腎、および後腎^1：哺乳類の腎臓は三つの段階を経て進行します。これらの腎臓形の基本フィルタリング部はネフロンで、両方の哺乳類や両生類は腎形成^2、3を受けるために、同じシグナル伝達カスケードおよび誘導のイベントを必要としている。 アフリカツメガエルの前腎は、近位の単ネフロン、中間遠位端との接続細管が含まれ、 （哺乳動物の糸球体に類似）とグロムス^1、4-6（ 図1 </strオング>）。 アフリカツメガエルの前腎に存在する単一の大きなネフロンは腎臓の開発と疾患過程に関与する遺伝子の研究のための単純なモデルとして、それが適しています。

細胞運命マップは初期のアフリカツメガエル胚のために設立され、Xenbase ^7-11オンラインで自由にご利用いただけますされています。同技術は、心臓や目などの他の組織を標的とするように適合させることができるが、ここでは、発展途上アフリカツメガエル前腎を対象とする系統のトレーサーのマイクロインジェクションのための技術が記載されています。リネージュトレーサーは、開発中にその細胞の子孫の可視化を可能にする、初期の割球に注入することができる（生体染色色素を含む、蛍光標識されたデキストラン、組織化学的に検出可能な酵素、およびmRNAは、蛍光タンパク質をコードする）ラベルです。このプロトコルは、系統のトレーサーとして膜対象と赤色蛍光タンパク質^12をコードする、MEM-RFPのmRNAを利用しています。対象となるマイクロインジェクション技術ここで説明した4および8細胞胚における個々の割球のためのniquesは、目的の遺伝子を過剰発現するように遺伝子発現、または外因性RNAとをノックダウンするモルフォリノの注射のために利用することができます。腹側、植物割球に注入することにより、主に胚の前腎が発育コントロールとして、対前腎を残して、標的にされるであろう。トレーサーの同時注射は正しい割球を注入し、胚における組織ショーは前腎のターゲティングを検証し、注入された割球から生じたかどうかを確認します。前腎の免疫染色は、前腎細管が標的にされているどれだけの可視化を可能にします。過剰発現およびノックダウン効果は、その後発達対照として胚の反対側に対してスコア付けすることができ、前腎指標^13を計算するために使用することができます。細胞運命マップの利用可能性は、この標的マイクロインジェクション技術はOTH組織を標的化するために使用されることを可能にしますえー前腎、および蛍光トレーサーの同時注射よりも、各組織を標的とするマイクロインジェクション分析する前に確認することができます。

胚のマイクロインジェクションの間に、発達の温度はアフリカツメガエルの開発の速度が¹⁴に大きく依存することを考えると、厳密に調節されるべきです。開発時間が遅くなるため、4および8細胞注射のために – （16°C 14）胚は低い温度でインキュベートされるべきです。 16で3ステージする°Cの開発時間は約4時間である22℃で、3（4細胞）ステージの段階1（1セル）から現像時間は、約2時間です。これは、22℃で8細胞（ステージ4）胚に4細胞期胚から行くのに約15分かかりますが、16℃で約30分かかります。同様に、22℃で、それだけで16細胞期胚（ステージ5）に進むに8細胞期胚のために30分かかります。この時間は、16℃で45分間に増加されます。ザrefore、胚、16細胞期に進行する前に8細胞期での注射のために十分な時間を可能にするために胚の発達の速度を遅くするのに有用です。腎臓が完全に発達するまでさらに、成長温度、速度または遅い胚発生を調節することができます。

オタマジャクシ期アフリカツメガエル胚の表皮は、郭清または組織¹⁵のクリアせずに開発する前腎の容易なイメージングを可能にする、比較的透明です。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明度に、ライブセルイメージングはまた^、16,17実現可能です。前腎 ​​を可視化するために免疫染色ホールマウント近位にラベルを確立する抗体、ステージの中間、遠位端と接続する細管38で可能です- アフリカツメガエル胚^18-20における遺伝子発現の標的操作の後に前腎開発の評価を可能にする40の胚。