Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
الكلى الجنينية من القيطم المورق (ضفدع)، وسليفة الكلوة، يتكون من كليون واحد، ويمكن استخدامها كنموذج لأمراض الكلى. الأجنة القيطم كبيرة، وتطوير خارجيا، ويمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خرائط مصير لأجنة القيطم مبكرة. حقن مكروي المستهدفة في قسيم أرومي الفردية التي من شأنها أن تؤدي إلى عضو أو نسيج من الفائدة في نهاية المطاف يمكن استخدامها لبإفراط بشكل انتقائي أو هدم التعبير الجيني داخل هذه المنطقة المحظورة، والحد من الآثار الثانوية في بقية الجنين النامي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية الاستفادة من إنشاء خرائط مصير القيطم لاستهداف القيطم الكلى تطوير (وسليفة الكلوة)، من خلال حقن مكروي إلى قسيم أرومي معين من الأجنة 4- و8 خلايا. حقن استشفاف النسب يسمح بالتحقق من استهداف معين من الحقن.بعد الأجنة قد وضعت لمرحلة 38-40، كلها جبل المناعية يستخدم لتصور تنمية سليفة الكلوة، ومساهمة من قبل خلايا تستهدف سليفة الكلوة يمكن تقييمها. يمكن تكييفها نفس الأسلوب لاستهداف أنواع الأنسجة الأخرى بالإضافة إلى سليفة الكلوة.
الكلى الجنينية القيطم، وسليفة الكلوة، هو نموذج جيد لدراسة تطور أمراض الكلى و. تكوين الجنين من الخارج، كبيرة الحجم، يمكن أن تنتج بأعداد كبيرة، والتلاعب بها بسهولة من خلال حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها الجينات التي تحكم تطور الكلى في الثدييات والبرمائيات. الكلى الثدييات التقدم من خلال ثلاث مراحل: سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية 1، في حين البرمائيات الجنينية لديها سليفة الكلوة والبرمائيات الكبار لديهم الكلوة التالية. وحدة التصفية الأساسية لهذه الأشكال الكلى هي كليون، وكل من الثدييات والبرمائيات تتطلب نفس شلالات الإشارات والأحداث الاستقرائية للخضوع لتكون الكلية 2 و 3. وسليفة الكلوة القيطم يحتوي على كليون واحد يتألف من الداني والمتوسط والبعيد، وربط الأنابيب، والكبة (مشابهة لالكبيبة الثدييات) 1 و4-6 (الشكل 1 </strأونج>). في واحد، كبير كليون موجودة في سليفة الكلوة القيطم يجعلها مناسبة كنموذج بسيط لدراسة الجينات المسؤولة عن عمليات التنمية الكلى والأمراض.
وقد وضعت خرائط مصير خلية للأجنة القيطم في وقت مبكر، وتتوفر على الانترنت في Xenbase 7-11 بحرية. هنا، نحن تصف تقنية ل microinjection من استشفاف النسب لاستهداف سليفة الكلوة القيطم النامية، على الرغم من أن نفس الأسلوب يمكن تكييفها لاستهداف الأنسجة الأخرى مثل القلب أو العينين. استشفاف النسب هي تسميات (بما في ذلك الأصباغ الحيوية، dextrans fluorescently المسمى، والانزيمات التي يمكن اكتشافها الكيميائيه النسيجيه، ومرنا ترميز البروتينات الفلورية) التي يمكن حقنها إلى قسيم أرومي في وقت مبكر، والسماح للتصور من سلالة تلك الخلية خلال التنمية. يستخدم هذا البروتوكول MEM-طلب تقديم العروض مرنا، غشاء ترميز استهدف الحمراء بروتين فلوري 12، والتتبع النسب. التكنولوجيا حقن مكروي المستهدفةniques لعن Blastomeres الفردية في الأجنة 4- و8 خلايا وصفها هنا يمكن أن تستخدم للحقن مع morpholinos لاسقاط التعبير الجيني، أو مع RNA خارجي لبإفراط عن الجين من الفائدة. عن طريق حقن في بطني، قسيم أرومي النباتي، في المقام الأول سيتم استهدفت سليفة الكلوة من الجنين، وترك سليفة الكلوة المقابل كعنصر تحكم التنموية. شارك في حقن التتبع يتحقق من أن قسيم أرومي الصحيح تم حقن، والعروض التي أنسجة في الجنين نشأت من قسيم أرومي حقن، والتحقق من استهداف سليفة الكلوة. المناعية للسليفة الكلوة يسمح تصور مدى تم استهداف الأنابيب سليفة الكلوة. ويمكن بعد ذلك Overexpression وضربة قاضية الآثار أن سجل ضد الجانب المقابل للجنين، والتي هي بمثابة السيطرة التنموية، ويمكن استخدامها لحساب مؤشر سليفة الكلوة 13. توافر خرائط مصير خلية يسمح هذا الأسلوب حقن مكروي المستهدفة لاستخدامها لاستهداف الأنسجة أوراسكوم تليكوم القابضةإيه من سليفة الكلوة، وشارك في حقن التتبع الفلورسنت يسمح للحقن مكروي الموجه إلى كل الأنسجة ليتم التحقق منها قبل التحليل.
خلال حقن مكروي الجنين، ينبغي تنظيم درجة حرارة التنموية بإحكام، بالنظر إلى أن معدل التنمية القيطم يعتمد اعتمادا كبيرا عليها 14. يجب حضنت الأجنة في درجات الحرارة (14-16 درجة مئوية) لحقن 4- و8 خلايا وذلك لأن سرعة تطور الزمن إلى أسفل. في 22 درجة مئوية، والوقت اللازم لتطوير من المرحلة 1 (1 الخلية) إلى مرحلة 3 (4 خلايا) ما يقرب من 2 ساعة، بينما في 16 درجة مئوية وقت التطوير إلى مرحلة 3 ما يقرب من 4 ساعات. يستغرق حوالي 15 دقيقة من نهاية المباراة من جنين 4 خلايا إلى 8 خلايا (المرحلة 4) الجنين في 22 درجة مئوية، ولكن يستغرق حوالي 30 دقيقة في 16 درجة مئوية. وبالمثل، في 22 درجة مئوية، فإنه يأخذ فقط 30 دقيقة لجنين 8 خلايا للتقدم إلى جنين 16 خلية (المرحلة 5). ويزداد هذا الوقت إلى 45 دقيقة في 16 درجة مئوية. الrefore، من المفيد أن يتباطأ معدل نمو الأجنة لتمكين ما يكفي من الوقت لحقن في مرحلة 8 خلايا قبل التقدم الأجنة إلى مرحلة 16 خلية. بالإضافة إلى ذلك، ودرجات حرارة النمو يمكن أن يكون منظم لتسريع أو إبطاء التطور الجنيني حتى وضعت الكلى تماما.
البشرة من الشرغوف مرحلة الأجنة القيطم شفافة نسبيا، مما يسمح للتصوير السهل من سليفة الكلوة النامية دون تشريح أو إزالة الأنسجة 15. نظرا لشفافية النسبية للأجنة القيطم، ويعيش التصوير الخلية هو أيضا من الممكن 16،17. كامل جبل المناعية لتصور سليفة الكلوة من الممكن مع الأجسام المضادة ثبت أن تسمية القريبة والمتوسطة، القاصي وربط الأنابيب من مرحلة 38-40 الأجنة التي تسمح لتقييم التنمية سليفة الكلوة بعد استهداف التلاعب في التعبير الجيني في الأجنة القيطم 18-20.
استهداف سليفة الكلوة تطوير الأجنة القيطم تعتمد على تحديد وحقن قسيم أرومي الصحيح. حقن قسيم أرومي V2 الأجنة 8 خلايا يستهدف سليفة الكلوة اليسرى (18). هذا يترك سليفة الكلوة اليمنى المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. إذا morpholino ضربة قاضية أو يستخدم overexpression RNA لتغيي…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة NIDDK (K01DK092320) وتمويل بدء التشغيل من قسم طب الأطفال في جامعة تكساس مدرسة ماكغفرن الطبية.
Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
HEPES | Fisher | BP310-500 | |
EDTA | Fisher | S311-500 | |
Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
MOPS | Fisher | BP308-500 | |
EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
Methanol | Fisher | A412-4 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |