Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
그들이 다시 챔버를 현미경하고 챔버를 처리하는 인큐베이터에서 이동할 때 CPF에서 성장 세포는 산소 또는 이산화탄소 농도의 변경을 볼 수 없습니다. 각 실의 조건이 세포 배양기에서 제거되기 전에 세포가 유지되는 특정 인큐베이터에 일치하는 것이 중요합니다. 장치 내의 분위기가 연속적 HEPA 여과하고 산소와 이산화탄소의 농도와 관련하여 정의 할 수 있습니다. 세포 또는 PSC를 NSCs의 5 %는 각각 9 %, 표준 농도에서 성장 될 수있다; 또는 대안 농도는 다른 세포 유형 또는 특정 실험을 위해 선택 될 수있다. 따라서, 상기 장치는 의료용 산소, 이산화탄소 및 질소 (도 4)의 일정한 소스로 공급된다. 이 가스의 세 가지 상수 공급을 위해 가스 관련 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 상기 장치는 또한 교정 가스 혼합물로 이루어진 공급되고산소 10 % (± 0.01 %), 이산화탄소. 상기 매니 폴드 시스템은 셀 생산 설비 밖에 수용하고 가스가 천정 설비에 배관되어있다. 교정 가스 설비 내에 수납된다. 장치는 또한 또한 천장을 통해, 집 진공와 함께 제공됩니다. 송신 장치를 전자 제어 시스템을 사용하여 무선 모든 매니 폴드의 출력 압력을 지속적으로 모니터링한다. 모든 압력 범위를 벗어날 경우, 상기 셀 생산 설비 오퍼레이터는 자동적으로 전화를하고 적절한 조치를 취할 수 있도록 통지한다.
장치의 전력 요건은 천장 내림차순 여섯 120 V 전용 회로에 의해 충족 일정한 공급을 보장하기 위해 병원의 백업 발전기에 접속된다. 장치의 작동은 무정전 전원 공급 장치를 통해 구동되는 PC 기반 컴퓨터 소프트웨어를 통해 제어된다. 이러한 전원과 컴퓨터 준비확인이 계속에도 공용 전력 시스템 장애 발생 시스템 기능. 상기 장치를 제어하는 소프트웨어는 산소 및 이산화탄소 농도의 제어뿐만 아니라, 온도, 습도, 및 챔버 압력을 허용하는 사용자에게 친숙한 그래픽 인터페이스 (도 1)을 갖는다. 모든 이들 파라미터의 값은 연속적으로 모든 장치 파라미터의 주행 기록을 제공하기 위해 기록된다. 이 데이터 무결성을 보호하기 위해 매일 밤마다 원격 서버에 백업됩니다. 컴퓨터 및 소프트웨어 평가 및 / 또는 매개 변수를 변경하려면 관리자 사용자가 원격으로 액세스 할 수 있습니다. 또한, 컴퓨터 소프트웨어는 장치 파라미터 대화식 평가를 허용하고 로컬 사용자와 해결 원격으로 액세스 될 수있다. 부가 경보 전송 장치는 상기 장치에 접속되어 전지의 생산 시설 운영자가 장치의 모든 범위를 벗어난 상태를 통지되도록. 원격 액세스 Capabilities은 로그인하고 범위를 벗어난 조건의 세부 평가 할 수 있습니다.
장치는 모듈 형 시스템으로 모두 매크로와 마이크로 의미로 설계되어 있습니다. 이러한 인큐베이터 및 처리 챔버 등의 개별 세포 배양 모듈은, 서로에 대하여 그들의 크기 및 요구 사항에 관해서뿐만 아니라 레이아웃에 정의 될 수있다. 또한, 각 모듈의 제어 기능의 대부분은 자체 모듈 같은 개별 분위기 가스 컨트롤러, 예를 들어, 용이하게 시스템의 상당한 중단없이 교체 될 수있다.
이러한 미세 시각화 및 세포 배양의 조작 하나로 특수 처리 챔버가 쉽게 시스템에 적합하다. 두 위상차 형광 현미경은 살아있는 세포 염색 할 수 있도록, 시스템 (도 6) 내부에서, 그리고 콜로니 t 내부와 같은 대기 조건에 절개 될 수있다그는 인큐베이터. 처리 챔버의 측벽에 밀봉 고리를 통해 케이블 라우팅 전원 공급 장치 및 시스템은 일반적으로 카트 (도 6)에서, 상기 장치의 외부에 유지되어야하는 등의 장치를 허용한다.
셀 생산 설비의 공정 챔버는 종래의 BSC는 상이한 기류 패턴을 갖는다. 기존의 BSC들에서, 공기 흐름은 중앙 배기구에서 아래로 흐르는 다음 캐비닛의 바닥의 전방 및 후방 부분에 두 개의 서로 다른 흡기구에 의해 흡수되는 두 개의 스트림으로 분할합니다. 대조적으로, CPF 천장의 전방 부에서 단일 배출구를 갖는다. 공기는 하향으로 그리고 그 후 흡기 벤트에 상향 인출되는 챔버의 후방을 향해 유동한다. CPF는 본래 매우 청결하지만,이 독특한 기류 패턴 기술자 약간 오염의 위험을 줄이기 위해 자신의 기술을 조정해야한다는 것을 의미한다. 기존의 BSC, 실험실 작업자들과 마찬가지로오픈 세포 배양 접시와 미디어 병의 상류에 손을 배치 hould 마십시오. 그러나, 상류 측 방향은 CPF에 변경되었는지
셀 생산 설비 실험실 자체가 상당히 표준이며, -20 ° C의 냉동고가 장착되어, -80 ° C의 냉동고, 4 ° C 냉장고, 원심 분리기, 수욕. 실험실은 편리한 핸즈프리 작동을위한 발 컨트롤 싱크대가 있습니다. 기능성 임상 셀 생산 설비가되는이 실험 위해서는 그러나 여러 추가적인 변형이 여전히 이루어져야한다. 우선, 상기 장치 자체는 휘발성 유기 화합물, 미립자 및 오염 제거에 사용되는 이산화 염소의 농도를 모니터링 할 수있는 능력이 업그레이드되어야한다. 둘째하는 FACS 시스템을 포함하는 처리 챔버를 수용하고 버퍼 모듈을 통해 상기 장치의 나머지 부분에 연결될 수있다. 이것은 셀 정렬 및 TR 정화용 허용적절한 환경 조건 하에서 ansplantable 세포 집단. 마지막으로, 장치 전체 부드러운 벽 클린 룸 내에 보관되어야한다. 이 장치 (5)에 대한 표준화기구 (ISO) 클래스 8 환경에 대한 국제기구를 제공합니다.
CPF의 높은 불임 및 컴퓨터 제어 특성은 세포 기반 치료 양호한 제조 공정 미래 애플리케이션에 이상적인 시스템을 만든다. 오염의 위험이 크게 완화되어 있지만, 더 중요한 것은, 전지 팽창 조건을 자동으로 기록하고, 컴퓨터 시스템에 의해 보관된다. 가스 농도, 온도, 습도 및 시스템에 액세스하는 모든 이벤트의 편차는 엄격하게 설명되어 있습니다. 제품 품질 문제를 조사하는 경우에 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 여전히 한계가있다. 일체의 시약 및 소모품의 사용은 (예를 들면, 미디어 구성 요소, 피펫, 플레이트) 별도로 문서화해야합니다. 더하다itionally의 CPF의 모니터링 시스템에 의해 문서화 변수는 전혀 관련이있는 발생할 수있다 (인간의 오류의 다양한 형태 포함) 잠재적 인 문제의 다수가 있습니다. 따라서, 고도로 훈련 된 인력과 작업에 대한 자세한 설명서 설명서에 대한 필요성이 장소에 남아 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Xvivo 동봉 된 세포 배양 시스템, 특히 매트 프리먼를 사용하는 학습에서의 도움을 Biospherix에서 직원을 인정하고 싶습니다; 마일즈 & 켈리 건설 회사, 실험실 인프라, 특히 러스 휴즈를 설정에서 자신의 작품에 대한 Inc.의 직원; 실험실 리모델링, 특히 아담 Lukhard와 데빈 Hugie 조정에 업무 시설 및 지원 서비스의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 데이터 관리 인프라 및 원격 액세스, 특히 베트남 트란을 설정하는 그들의 도움에 대한 정보 시스템의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 프로젝트, 특히 박사 마리아 Minon와 브렌트 Dethlefs 자신의 오랜 지원을위한 오렌지 카운티 경영진 팀의 아동 병원. 이 작품은 어린이 오렌지 카운티의 병원 회생 Medicin에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 투자되었다PHS에 부여 TR3-05476을 통해 전자. 모든 저자는이 작품에 동일하게 기여했다.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |