Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה
Summary
Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
Abstract
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Introduction
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים שגודלו בתוך ע.מ. רואים שום שינויים בריכוזים דו חמצן או פחמן, כאשר הם עוברים מן החממה כדי עיבוד בתא עד מיקרוסקופ חדר ובחזרה. זה קריטי, כי תנאים בתא אחד מותאמים בחממה המסוימת שבה התאים נשמרים לפני התאים יוסרו מן החממה. האווירה בתוך המנגנון היא ברציפות HEPA-מסוננת ניתן להתאמה אישית בכל נוגע ריכוזי דו תחמוצת חמצן ופחמן. תאים ניתן לגדל בריכוזי תקן PSCs או NSCs, 5% ו -9%, בהתאמה; או ניתן לבחור ריכוזים חלופיים תאים מסוגים שונים או עבור ניסויים ספציפיים. לפיכך, המנגנון מסופק עם מקורות מתמידים של חמצן כיתה רפואית, פחמן דו חמצני, חנקן (איור 4). כל שלושה גזים אלה מסופקים על ידי מערכות סעפת ספציפית-גז המבטיחות אספקה מתמדת. המנגנון מסופק גם עם תערובת גז כיול מורכבת10% (± 0.01%) פחמן דו חמצני לחמצן. מערכות סעפת שוכנות מחוץ למתקן ייצור תאים והגזים נשמעים ברקע לתוך המתקן דרך התקרה. גז הכיול שוכן בתוך המתקן. המנגנון מסופק גם עם ואקום הבית, גם דרך התקרה. באמצעות מערכת ניטור אלקטרונית ואלחוטי יחידות שליחה, לחצי הפלט של כל הסעפות מנוטרים באופן קבוע. במקרה שכל לחץ נופל מחוץ לטווח, מפעילי מתקן ייצור תאים הם טלפנו באופן אוטומטי הודעה כזו פעולה מתאימה ניתן לקחת.
דרישות הכח של המנגנון שלו ממומנות על ידי שישה 120 ייעודי V מעגלים יורדים מהתקרה ומחוברות מחוללי הגיבוי של בית החולים על מנת להבטיח אספקה קבועה. מבצע של המנגנון נשלט באמצעות תוכנה במחשב PC המבוסס מופעל באמצעות אספקת חשמל פסק. הסדרי כוח ומחשב אלהלהבטיח כי פונקציות המערכת ברציפות גם במקרה של כשל במערכת חשמל ציבורי. תוכנת השליטה במנגנון בעלת ממשק גרפי ידידותי למשתמש (איור 1) אשר מאפשר השליטה הריכוזית דו תחמוצת חמצן והפחם וכן טמפרטורה, לחות, ולחצים קאמריים. הערכים של כל הפרמטרים הללו נרשמים באופן רציף על מנת ליצור רשום מצטבר של כל פרמטרי המנגנון. נתונים אלה מגובים על גבי שרת מרוחק מדי לילה כדי להגן על שלמותם. המחשב והתוכנות ניתן לגשת מרחוק על ידי משתמשים מנהליים להעריך ו / או לשנות כל פרמטר. בנוסף, המחשב ותוכנות ניתן לגשת מרחוק, המאפשרים הערכה אינטראקטיבית של פרמטרי מנגנון ופתרון בעיות עם משתמשים מקומיים. יחידת שליחת אזעקה נוספת מחובר למנגנון כזה מפעילי מתקן ייצור תאים מקבלים הודעה על כל out-of-טווח במצב של המנגנון. ג הגישה מרחוקapabilities לאפשר להתחבר והעריך את הפרטים של המצב מחוץ לטווח.
המנגנון נועד כמערכת מודולרית הן מאקרו ותחושה מיקרו. מודולים תרבית תאים בודדים, כגון חממות ותאי עיבוד, יכול להיות מותאם אישית בכל הנוגע לממדים ודרישתם וכן בפריסה שלהם ביחס לזה. בנוסף, מרבית הפונקציות השליטות על מודולים הבודדים הם עצמם כאלה מודולרי בוקר גז האטמוספרי פרט, למשל, עשויים להיות מוחלפים בקלות ללא הפרעה משמעותית למערכת.
תאי עיבוד מיוחדים, כגון אחד עבור להדמיה מיקרוסקופית ומניפולציה של תרביות תאים, ניתנים להתאמה בקלות למערכת. שני השלב בניגוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הם בתוך המערכת (איור 6), כך תאים יכולים להיות מוכתם חי, ומושבות יכולות להיות גזורות באותם תנאים אטמוספריים כמו בתוך tהוא אינקובטורים. ניתוב של כבלים דרך grommets חתום הקירות הצדדיים של חדר העיבוד מאפשר ציוד כגון ספקי כוח ומחשבים להישמר מחוץ המנגנון, בדרך כלל על עגלה (איור 6).
לתאי העיבוד במתקן ייצור תאים יש דפוס זרימת אוויר שונה מאשר BSCs הקונבנציונלי. בשנת BSCs הקונבנציונלי, זרימת אוויר זורם במורד מתוך פורקן פליטה מרכזי מתפצלת לשני זרמים נפרדים, אשר נלקחים מכן על ידי שני פתחי צריכה שונים בחלק קדימה ומאחור של הרצפה של הארון. לעומת זאת, ע.מ. יש פורקן יחיד בחלק הקדמי של התקרה. האוויר זורם כלפי מטה לכיוון החלק האחורי של החדר, שם הוא נמשך מכן כלפי מעלה לתוך פורקן צריך. למרות ע.מ. הוא מטבעו מאוד נקי, דפוס זרימת אוויר ייחודי זה אומר טכנאים צריכים להתאים את הטכניקה שלהם מעט כדי להפחית את הסיכון לזיהום. כמו עם BSC מקובלת, עובד במעבדהhould להימנע מלהציב את ידיהם נגד זרם של צלחות תרבית תאים פתוחות ובקבוקי תקשורת. עם זאת, כיוון שהוא הזרם השתנה ב ע.מ.
המעבדה מתקן ייצור התאים עצמו הוא סטנדרטי למדי ו מגיע מאובזר עם מקפיא -20 ° C, -80 ° C במקפיא, מקרר 4 ° C., בצנטריפוגה, ואמבט מים. המעבדה גם יש כיור עם דוושות מבצע דיבורית נוח. על מנת במעבדה הזאת להפוך למתקן ייצור תאים קליני תפקודי, אולם מספר שינויים נוספים עדיין חייבות להתבצע. ראשית, המנגנון עצמו יש לשדרג כדי לקבל את היכולת לפקח על תרכובות אורגניות נדיפות, חלקיקים, וריכוזים של דו תחמוצת כלור המשמש טיהור. שנית, תא עיבוד המכיל מכונה FACS ניתן שוכן ומחובר שאר המנגנון באמצעות מודול חיץ. זה יאפשר מיון תא וטיהור trאוכלוסיות תאי ansplantable בתנאים הסביבתיים המתאימים. לבסוף, המנגנון כולו צריך להיות שוכן בתוך חדר נקי חומה רכה. זה מספק ארגון התקינה הבינלאומי הסביבה (ISO) בכיתה 8 למנגנון 5.
על סטריליות הגבוהה וטבע מבוקרת מחשב של ע.מ. עושים את זה מערכת אידיאלית עבור יישומים עתידיים עם טיפול מבוסס תאים ותהליכי ייצור נאותים. הסיכון של זיהום היא מיתנה מאוד, אבל יותר חשוב, את התנאים של הרחבת התא נרשמות באופן אוטומטי לארכיון על ידי מערכת המחשב. סטיות בריכוזי גז, טמפרטורה, לחות, וכל אירועי גישה למערכת מתועדות בקפדנות. זה יכול לעזור מאוד כאשר חוקר בעיות איכות המוצר. עם זאת, ישנם עדיין מגבלות. השימוש של כל וכל ריאגנטים ואספקה (למשל, רכיבי תקשורת, טפטפות, צלחות) חייב להיות מתועד בנפרד. לְהוֹסִיףitionally, יש שפע של בעיות פוטנציאליות (כולל צורות רבות של טעות אנושה) שיכול להתעורר אשר אינם קשורים זה לזה לחלוטין כדי המשתנים מתועד על ידי מערכת הניטור של CPF. לפיכך, את הצורך צוות מקצועי מהשורה הראשונה ותיעוד מדריך מפורט של משימות נשאר במקום.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לצוות Biospherix על עזרתם ללמוד להשתמש במערכת תרבית תאים סגורים Xvivo, במיוחד מאט פרימן; צוות של חברת בניית Miles & קלי, Inc עבור עבודתם בהקמת תשתית המעבדה, במיוחד ראס יוז; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת אורנג 'קאונטי של מתקנים ושירותים תמיכה עבור עבודתם בתיאום לשפץ מעבדה, במיוחד אדם Lukhard ודווין Hugie; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת Orange County של מערכות מידע על עזרתם בהקמת התשתית לניהול נתונים וגישה מרחוק, במיוחד וייט טראן; בית החולים של צוות הניהול הבכיר של מחוז אורנג 'של ילדים לתמיכה ארוכת השנים שלהם של הפרויקט, במיוחד ד"ר מריה Minon וברנט Dethlefs. עבודה זו מומנה על ידי בית החולים לילדים של מחוז אורנג 'המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואהדואר דרך TR3-05476 מענק PHS. כל המחברים תרמו באופן שווה על עבודה זו.
Materials
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Consumable Supplies | |||
| 2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children’s Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases – the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
