歯科バイオフィルムにおける細胞外のpHのレシオメトリックイメージング

ここに記載された方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡と組み合わせて、レシオメトリック色素seminaphthorhodafluor-4F 5-（および6）を使用して、4.5と7の間の範囲内の歯科バイオフィルム中のカルボン酸（C-SNARF-4）の細胞外のpHをモニターし、できデジタル画像解析。採用蛍光色素はpH感受性であり、プロトン化の状態に応じて、その蛍光発光の変化を表示します。 580 nmでのプロトン化分子のピークの蛍光発光、及び640nmの¹での脱プロトン化分子の発光。 2つの発光ピークを含む二つの検出窓における蛍光発光強度の比は、（576 – 608 nmで629 – 661 nm）はこのようにかかわらず、染料濃度の、液相のpHを反映します。 〜6.4 _のpKaを有する色素が適度に酸性の環境のpHを視覚化するのに適しています。

細菌バイオフィルム中のPHは、すべての代謝プロセスのための中心的な重要性です。歯のバイオフィルムの場合には、細胞外マトリックス中のpHは、虫歯の開発のための重要な病原性因子です。バイオフィルム歯インタフェースリードでの低pHの拡張期間が根底にあるエナメル質²の脱灰を遅らせることを意味します。有機酸を含むバイオフィルム、代謝産物の複雑な3次元構造に、均一にバイオフィルム全体に分散されていません。非常に少ない酸産生微小環境は、空間的に近接³に見出すことができます。

何十年もの間、バイオフィルムの縦pH勾配は、微小電極^4-6の助けを借りて記録しました。彼らは、小さなチップサイズのための良好な空間分解能を提供していますが、彼らは水平勾配を監視する非常に適していません。また、電極の挿入は、機械的に、バイオフィルムを乱します。定量的蛍光顕微鏡技術は、機械的な干渉なしに、バイオフィルムの異なる領域におけるpH変化を可視化するという利点を提供しますNCE。ビューの異なる顕微鏡視野を自由に選択し、長期間^1,7-9にわたって繰り返し撮像することができます。顕微鏡バイオフィルムの画像を解釈するときしかし、細胞外空間から派生微生物バイオマス及び蛍光に由来する蛍光を区別することが重要です。細菌が活発にアデノシン三リン酸¹⁰を犠牲にし、それらの細胞膜を横切ってプロトンを輸送するように酸性条件下では、細菌細胞内部のpHは、細胞外マトリックス中のpHと異なっています。低細胞外pHは脱灰につながる一方、虫歯の文脈において、細胞内細菌のpHが根底にあるエナメル質に直接影響を持っていません。細菌フリーエリアと細菌の両方を含む顕微鏡画像で平均化pHは、誤った結果につながります。細菌バイオマスを視覚化し、細胞外および細胞内領域を区別するために、pH感受性色素と一緒に他の汚れの使用は、ABをもたらします¹¹外空間と偽の測定値の蛍光汚染のリスクアウト。

本原稿は、したがって、二重の機能でレシオメトリック色素の使用を記載します。 pHをマーカーとしておよびユニバーサル細菌染色の両方。染料は、細菌細胞中に濃縮ように、共焦点顕微鏡画像で正確なデジタル画像分析手順の組み合わせは4.5と細い歯科用バイオフィルムにおける7.0の範囲の外のpHを測定することができます。