Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

El método aquí descrito permite el seguimiento de pH extracelular en biofilms dentales en el intervalo entre 4,5 y 7, usando el colorante radiométrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (y-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis de imagen digital. El colorante fluorescente empleado es sensible al pH y muestra un cambio en su emisión fluorescente en función del estado de protonación. La emisión fluorescente de los picos de moléculas protonadas en 580 nm, y la emisión de la molécula desprotonado a 640 nm ^1. La relación de las intensidades de emisión fluorescente en dos ventanas de detección que comprende los dos picos de emisión (576-608 nm y 629-661 nm) refleja así pH en la fase líquida, con independencia de la concentración de colorante. Con un pK _a de ~ 6,4 el colorante es adecuado para visualizar pH en ambientes moderadamente ácidas.

PH en las biopelículas bacterianas es de vital importancia para todos los procesos metabólicos.En el caso de biofilms dentales, pH en la matriz extracelular es el factor de virulencia clave para el desarrollo de la caries dental. Los períodos prolongados con un pH bajo en la interfaz de plomo-biopelícula dental para frenar la desmineralización del esmalte subyacente ^2. Debido a la compleja arquitectura tridimensional de biofilms, metabolitos, incluyendo ácidos orgánicos, no se distribuyen uniformemente a través de la biopelícula. Altamente y menos microambientes acidogénicas se pueden encontrar en estrecha proximidad espacial ^3.

Durante décadas, los gradientes de pH verticales en biofilms se registraron con la ayuda de microelectrodos ^4-6. Mientras que ofrecen una buena resolución espacial debido a su pequeño tamaño de la punta, no son muy adecuados para controlar los gradientes horizontales. Por otra parte, la inserción del electrodo perturba el biofilm mecánicamente. Cuantitativos técnicas microscópicas fluorescentes ofrecen la ventaja de visualizar los cambios de pH en las diferentes áreas de un biofilm sin interferir mecánicana vez. Diferentes campos microscópicos de vista se pueden seleccionar libremente y la imagen varias veces durante periodos prolongados ^1,7-9. Sin embargo, al interpretar imágenes microscópicas de biofilm, es importante distinguir entre la fluorescencia que deriva de la biomasa microbiana y la fluorescencia derivada del espacio extracelular. En condiciones ácidas, el pH dentro de las células bacterianas es diferente de pH en la matriz extracelular, como las bacterias transportan activamente protones a través de su membrana celular a expensas de trifosfato de adenosina ^10. En el contexto de la caries dental, pH intracelular bacteriana no tiene un impacto directo sobre el esmalte mientras que subyacen bajo pH extracelular conduce a la desmineralización. Un promedio de pH en imágenes microscópicas que contienen ambas áreas y bacterias libres de bacterias conduce a resultados erróneos. El uso de otros a lo largo de las manchas con el colorante sensible al pH con el fin de visualizar la biomasa bacteriana y diferenciar entre las áreas extra e intracelulares trae abel riesgo de contaminación fluorescente del espacio extracelular y mediciones falsas ^11.

Por consiguiente, la presente manuscrito describe el uso del colorante radiométrico en una doble función; tanto como un marcador de pH y como una mancha bacteriana universal. A medida que el tinte es up-concentra en las células bacterianas, la combinación de imágenes microscópicas confocal y un procedimiento de análisis de imagen digital precisa permite la determinación de pH extracelular en el intervalo entre 4,5 y 7,0 en las biopelículas dentales delgados.