Imagerie Ratiométrique du pH extracellulaire dans biofilms dentaires

Le procédé décrit ici permet de surveiller le pH extracellulaire dans les biofilms dentaires dans la plage comprise entre 4,5 et 7, en utilisant le colorant ratiométrique seminaphthorhodafluor-4F 5- (et-6), acide carboxylique (C-SNARF-4) en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et l'analyse d'image numérique. Le colorant fluorescent utilisé est sensible au pH et affiche un changement dans son émission de fluorescence en fonction de l'état de protonation. L'émission de fluorescence des pics moléculaires protonés à 580 nm et l'émission de la molécule déprotonée ¹ à 640 nm. Le rapport des intensités d'émission de fluorescence dans deux fenêtres de détection comprenant deux pics d'émission (576-608 nm et 629-661 nm) reflète ainsi le pH dans la phase liquide, quelle que soit la concentration de colorant. Avec un pKa de 6,4 ~ le colorant est adapté pour visualiser le pH dans un environnement modérément acides.

PH dans les biofilms bactériens est d'une importance capitale pour tous les processus métaboliques.Dans le cas des biofilms dentaires, le pH dans la matrice extracellulaire est le facteur de virulence essentiel pour le développement des caries dentaires. Des périodes prolongées de faible pH à l'interface biofilm-dent conduit à ralentir la déminéralisation de l'émail sous – jacent ^2. Grâce à l'architecture tridimensionnelle complexe de biofilms, des métabolites, y compris les acides organiques, ne sont pas répartis uniformément à travers le biofilm. Hautement et moins microenvironnements acidogènes se trouvent dans la proximité spatiale étroite ^3.

Depuis des décennies, des gradients de pH verticaux dans les biofilms ont été enregistrées à l'aide de micro – électrodes ^4-6. Bien qu'ils offrent une bonne résolution spatiale en raison de leur petite taille de la pointe, ils ne sont pas bien adaptés pour surveiller les gradients horizontaux. En outre, l'insertion de l'électrode perturbe le biofilm mécaniquement. techniques microscopiques fluorescentes quantitatives offrent l'avantage de visualiser les changements de pH dans différentes zones d'un biofilm sans interférer mécaniquence. Champs microscopiques de vue différents peuvent être choisis librement et imagées de manière répétée sur des périodes prolongées ^1,7-9. Cependant, lors de l'interprétation des images microscopiques biofilm, il est important de faire la distinction entre la fluorescence provenant de la biomasse microbienne et de la fluorescence provenant de l'espace extracellulaire. Dans des conditions acides, le pH à l' intérieur des cellules bactériennes est différent du pH dans la matrice extracellulaire, comme les bactéries transportent activement des protons à travers la membrane cellulaire , au détriment de l' adénosine triphosphate ^10. Dans le contexte de la carie dentaire, le pH intracellulaire des bactéries n'a pas un impact direct sur l'émail sous-jacent alors qu'une faible pH extracellulaire conduit à la déminéralisation. Étalement pH dans des images microscopiques qui contiennent à la fois des zones exemptes de bactéries et les bactéries conduit à des résultats erronés. L'utilisation d'autres tâches ainsi que le colorant sensible au pH pour visualiser la biomasse bactérienne et de différencier entre les régions extra- et intracellulaires apporte able risque de contamination fluorescente de l'espace extracellulaire et des erreurs de mesure ^11.

Le présent manuscrit décrit donc l'utilisation du colorant ratiométrique dans une double fonction; à la fois en tant que marqueur de pH et comme une tache bactérienne universelle. Comme le colorant est mis concentré dans des cellules bactériennes, la combinaison d'imagerie microscopique confocale et une procédure d'analyse d'image numérique précis permet la détermination du pH extracellulaire dans la plage comprise entre 4,5 et 7,0 dans les biofilms minces dentaires.