Ratiometrische Imaging van extracellulaire pH in Dental biofilms
Summary
Een pH-gevoelige ratiometrische kleurstof wordt gebruikt in combinatie met confocale laser scanning microscopie en digitale beeldanalyse extracellulaire pH in tandheelkundige biofilms in real-time te volgen.
Abstract
De pH in bacteriële biofilms op de tanden van cruciaal belang is voor tandbederf, een ziekte met een hoge prevalentie wereldwijd. Voedingsstoffen en metabolieten zijn niet gelijkmatig verdeeld in de tandheelkundige biofilms. Een complexe wisselwerking tussen sorptie van en reactie met organische stof in de biofilm vermindert de diffusiewegen van opgeloste stoffen en creëert steile hellingen van reactieve moleculen, zoals organische zuren, in de biofilm. Kwantitatieve fluorescentie microscopische methoden, zoals fluorescentie levensduur imaging of pH ratiometry, kan worden toegepast om pH visualiseren verschillende micro-omgevingen van tandheelkundige biofilms. pH ratiometry exploiteert een pH-afhankelijke verandering in de fluorescentie-emissie van pH-gevoelige kleurstoffen. Berekening van de emissiegraad bij twee verschillende golflengten maakt bepaling lokale pH in microscopische beelden, ongeacht de concentratie van de kleurstof. Anders dan de micro-elektroden techniek maakt controle zowel verticale als horizontale pH gradiënten in real-time metuit mechanisch de biofilm te verstoren. Wel moet ervoor worden gezorgd dat nauwkeurig onderscheid te maken tussen extra- en intracellulaire compartimenten van de biofilm. Hier, de ratiometrische kleurstof, seminaphthorhodafluor 4F-5- (en-6) carbonzuur (C-SNARF-4) gebruikt om extracellulaire pH in in vivo gekweekt tandheelkundige biofilms van onbekende soorten samenstelling volgen. Bij blootstelling aan de kleurstof glucose up geconcentreerd binnen alle bacteriecellen in de biofilms; het wordt dus gebruikt zowel als een universele bacteriële vlek en als marker van extracellulaire pH. Na confocale microscopische beeld overname, wordt de bacteriële biomassa verwijderd uit alle foto's met behulp van digitale beeldanalyse-software, die het mogelijk maakt om uitsluitend te berekenen extracellulaire pH. pH ratiometry de ratiometrische kleurstof goed geschikt voor extracellulaire pH in dunne biofilms tot 75 urn dikte bestuderen, maar is beperkt tot het pH gebied tussen 4,5 en 7,0.
Introduction
De hier beschreven methode maakt bewaking extracellulaire pH in tandheelkundige biofilms in het bereik tussen 4,5 en 7, met het ratiometrische kleurstof seminaphthorhodafluor 4F-5- (en-6) carbonzuur (C-SNARF-4) in combinatie met confocale laser scanning microscopie digitale beeldanalyse. De toegepaste fluorescerende kleurstof pH-gevoelig en wordt een verschuiving in de fluorescentie-emissie afhankelijk van de stand van protonering. De fluorescerende emissie van de geprotoneerde molecuul pieken bij 580 nm en de emissie van de gedeprotoneerde molecuul op 640 nm 1. De verhouding van de fluorescentie-emissie-intensiteiten in twee detectievensters omvattende twee emissiepieken (576-608 nm en 629-661 nm) geeft zo pH in de vloeistoffase, ongeacht de kleurstofconcentratie. Met een pKa van 6,4 ~ de kleurstof geschikt pH visualiseren matig zure milieus.
PH in bacteriële biofilms is van cruciaal belang voor alle metabole processen.Bij tandheelkundige biofilms pH in de extracellulaire matrix is de belangrijkste virulentiefactor voor de ontwikkeling van cariës. Langere periodes met een lage pH op de biofilm-tooth-interface leiden tot demineralisatie van de onderliggende glazuur 2 te vertragen. Vanwege de complexe driedimensionale architectuur van biofilms, metabolieten, zoals organische zuren, zijn niet gelijkmatig verdeeld over de biofilm. Sterk en minder acidogene microenvironments kan worden gevonden in de buurt ruimtelijke nabijheid 3.
Al decennia lang, werden verticaal pH gradiënten in biofilms opgenomen met behulp van micro-elektroden 4-6. Zij bieden een goede ruimtelijke resolutie door hun kleine tipgrootte, ze zijn niet goed geschikt om horizontale gradiënten te controleren. Verder inbrengen van de elektrode verstoort de biofilm mechanisch. Kwantitatieve fluorescentie microscopische technieken hebben het voordeel visualiseren pH veranderingen in verschillende gebieden van een biofilm zonder mechanische interfererenNVU. Verschillende microscopische gezichtsveld kan vrij worden gekozen en herhaaldelijk afgebeeld gedurende lange perioden 1,7-9. Echter, bij het interpreteren van microscopische beelden biofilm, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen fluorescentie die uit de microbiële biomassa en fluorescentie die uit de extracellulaire ruimte. Onder zure omstandigheden, pH binnen bacteriële cellen verschilt van de pH in de extracellulaire matrix, de bacteriën actief protonen in de celmembraan transporteren ten koste van adenosine trifosfaat 10. In het kader van cariës, heeft intracellulaire bacteriële pH niet een directe impact op de onderliggende glazuur hebben terwijl lage extracellulaire pH leidt tot demineralisatie. Gemiddeld pH in microscopische beelden die zowel bacteriën gebieden en bacteriën bevatten leidt tot foutieve resultaten. Het gebruik van andere vlekken met de pH-gevoelige kleurstof om de bacteriële biomassa te visualiseren en te differentiëren tussen extra- en intracellulaire gebieden brengt abhet risico van fluorescerende vervuiling van de extracellulaire ruimte en valse metingen 11.
De huidige manuscript beschrijft ook het gebruik van de ratiometrische kleurstof in een dubbele functie; zowel als pH marker en een universele bacteriële vlek. Aangezien de kleurstof-up geconcentreerd in bacteriële cellen, de combinatie van confocale microscopische beeldvorming en een nauwkeurige digitale beeldanalyse procedure maakt bepaling extracellulaire pH in het traject tussen 4,5 en 7,0 in dunne tandheelkundige biofilms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopisch onderzoek van biofilm pH verschaft verscheidene voordelen in vergelijking met micro-elektrode of elektrode metingen 4-6. Microscopische technieken toestaan pH met een hoge ruimtelijke resolutie vast en laat vastleggen zowel horizontale als verticale pH gradiënten in biofilms zonder biofilm mechanisch verstoren. Eerdere pogingen microscopisch pH-meting echter niet differentiëren tussen extracellulaire en intracellulaire pH in de biofilms 1,7,9. Door bacteriële homeostase, intr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag bedanken Javier E. Garcia en Lene Grønkjær voor technische bijstand en Merete K. Raarup voor vruchtbare discussies. Dit werk werd gefinancierd door Aarhus University Research Foundation en de Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
