在口腔生物膜细胞外pH值成比例成像
Summary
pH敏感比例染料以共聚焦激光扫描显微镜和数字图像分析结合用于监测实时牙科生物膜的细胞外pH值。
Abstract
牙齿上细菌生物膜的pH值是对于龋齿，具有高的全球流行的疾病至关重要。营养物和代谢物没有在牙科生物膜分布均匀。吸附并反应在生物膜有机物质之间复杂的相互作用降低了溶质的扩散路径，并创建活性分子的陡坡，包括有机酸，整个生物膜。定量荧光显微方法，例如荧光寿命成像或pH ratiometry，可以采用在牙科生物膜不同微环境可视化的pH值。 pH值ratiometry利用在pH敏感染料的荧光发射的pH依赖性移。在两个不同波长的发射的比例的计算允许确定在显微图像局部pH，不论染料的浓度。相反微电极的技术允许与监测实时垂直和水平的pH梯度出机械干扰生物膜。然而，必须小心以生物膜的细胞内外室之间准确区分。在这里，比例染料，seminaphthorhodafluor-4F 5-（和-6）羧酸（C-SNARF-4）被用来监测在未知物种组成的体内生长牙科生物膜的细胞外pH值。在暴露于葡萄糖的染料是向上集中在生物膜的所有细菌细胞内;因此它被用来作为一个通用细菌染色和细胞外pH值的标记。共聚焦显微图像采集后，细菌的生物量从使用数字图像分析软件，它允许以独占方式计算外pH的所有照片删除。 pH值ratiometry与比例染料是非常适合于研究高达75微米厚的薄的生物膜的细胞外pH值，但被限制在pH范围4.5至7.0之间。
Introduction
这里所描述的方法可以监控在牙科生物膜外pH在4.5和7之间的范围内，使用比例染料seminaphthorhodafluor-4F 5-（和-6）羧酸（C-SNARF-4）在共聚焦激光扫描显微镜组合和数字图像分析。所采用的荧光染料是pH敏感，并显示在其荧光发射取决于质子化的状态的转变。在580处的质子化分子峰的荧光发射，并且去质子分子在640nm 1的发射。荧光发射强度的两个探测窗口包括两个发射峰的比率（576 – 608 nm和629 – 661纳米）从而反映pH值在液相，不论染料浓度。用〜6.4的pK a的染料适用于适度酸性环境中的可视化的pH值。
PH值在细菌生物膜是对所有代谢过程至关重要。在牙科生物膜的情况下，pH值在细胞外基质为龋齿的发展的关键毒力因子。 pH值较低的生物膜牙接口引线过长，以减缓潜在的搪瓷2脱钙。由于生物膜，代谢物，包括有机酸的复杂的三维结构，不是均匀地在整个生物膜分布。高少产酸微环境可以紧密的空间接近3被发现。
几十年来，在生物膜垂直pH梯度进行记录微电极4-6的帮助。虽然他们提供了一个良好的空间分辨率，由于其小针尖大小，他们不是非常适合于监控水平梯度。此外，电极的插入机械干扰生物膜。荧光定量显微技术提供可视化生物膜中的不同区域的pH值的变化没有机械干扰的优势NCE。视不同的显微镜视野可以自由选择和过长时间1,7-9反复成像。然而，解译显微生物膜图像时，它的荧光从微生物生物质和荧光从细胞外空间导出导出区分是重要的。在酸性条件下，pH值的细菌细胞内是从pH值在细胞外基质不同，因为细菌在积极三磷酸腺苷10的费用运输在其细胞膜质子。在龋齿的上下文中，而低外pH导致脱矿质胞内细菌的pH不会对底层搪瓷有直接影响。在同时包含无菌区域和细菌显微图像均pH值会导致错误的结果。为了可视化的细菌的生物量和细胞内外区域之间区分使用具有pH敏感的染料沿着其它污渍带来从头出细胞外空间的荧光污染和假测量11的风险。
因此，本手稿描述了一个双重功能的比例染料;既作为pH标记，并作为通用细菌污点。作为染料是向上集中在细菌细胞中，共焦显微成像的组合和一个准确的数字图像分析过程允许在薄牙科生物膜确定4.5和7.0之间的范围外的pH值。
Protocol
Representative Results
Discussion
相比，电极或微电极测量4-6生物膜pH为微观监测提供了若干优点。显微技术允许确定pH值以高空间分辨率和允许在不机械地扰乱生物膜捕获在生物膜水平和垂直的pH梯度。的微观pH监测先前的尝试，但是，没能在生物膜1,7,9外和细胞内pH值之间进行区分。由于细菌的动态平衡，细胞内pH从外pH不同，并且如果内和细胞外隔室向记录荧光发射的pH计算可以是无效的。使用第二荧光染料与pH?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢哈维尔·加西亚·E.琳恩和对格隆克沙尔技术援助和莫雷特K. Raarup了富有成果的讨论。这项工作是由奥胡斯大学研究基金会资助并西蒙基金会探马。
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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