Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasten werden oft morphologisch spindelförmigen Zellen, die auf Kunststoffsubstraten haften definiert. Fibroblasten sind das Prinzip Zelltyp für die Synthese und den Umbau der extrazellulären Matrix in embryonalen und adulten Organen ¹ verantwortlich. Fibroblasten sind daher entscheidend für die Entwicklung von Säugetieren und tragen wesentlich zur extrazelluläre Milieu, das das Verhalten von benachbarten in jedem Gewebe und Organ vorliegenden Zelltypen beeinflußt.

Fibroblasten sind auch der Hauptzelltyp hinter eine vielfältige Reihe von medizinischen Bedingungen, die enorme klinische Belastung verursachen. Pathologische Fibroblastenaktivität beeinträchtigt die normale Gewebefunktion und umfasst Gewebe und Organfibrose (wie der Lunge und Leber), Narben nach kutaner Wundheilung, Atherosklerose, Sklerodermie und Bildung Atheromatoseplaques nach der Blutgefäßverletzung ^2-5. Wundheilung insbesondere akut und chronisch sowohl beinhaltet deposition von Narbengewebe, die weder ähnelt auch Aufgaben wie das normale Gewebe umgibt, und führt zu einer signifikanten Morbidität über verschiedene pathologische Zustände. Nach Verletzung, gibt es einen Übergang von Fibroblasten zu Myofibroblasten, die dann sezerStruktur ECM Komponenten auszuüben parakrine Wirkungen auf benachbarten Zelltypen und Wiederherstellen mechanische Stabilität durch Abscheiden Narbengewebe ^6.

In Hautgewebe besteht signifikante Abweichung in der Qualität der Wundreparatur in Entwicklungszeit zwischen anatomischen Stellen. In den ersten beiden Trimester des Lebens heilt der Fötus ohne Narbenbildung; jedoch von dem dritten Trimester auf und im Erwachsenenalter, Menschen heilen mit einer Narbe. Ortspezifische neben altersspezifische Unterschiede in der Wundheilung gibt. Wunden im Mundraum umzu mit minimaler Narbenbildung ^7,8, während Narbengewebeablagerung innerhalb kutanen Wunden signifikant ^9. Kontroverse besteht concerning den relativen Einfluss der Umwelt im Vergleich zu den intrinsischen Eigenschaften der lokalen Fibroblasten auf das Ergebnis der Wundheilung in Bezug auf sowohl Alter und Standort ^10,11. Anbetracht der bedeutenden Unterschiede bei der Heilung von Maus oral vs. kutanen Dermis und früher embryonaler (E15) gegenüber späteren embryonalen (E18) Dermis, ist es wahrscheinlich, dass die intrinsische Unterschiede in den Populationen von Fibroblasten bei bestimmten Entwicklungs Alters und unter verschiedenen anatomischen Stellen existieren .

Im Jahr 1986, Harold F. Dvorak gesetzten Tumoren sind Wunden, die nicht heilen ^12. Dvorak geschlossen, dass Tumoren verhalten sich wie Wunden im Körper und induzieren ihre Stroma durch Aktivieren der Wundheilungsreaktion des Wirts. Zahlreiche Studien haben seit sucht den Beitrag von Fibroblasten zur Progression von Karzinomen ^13-15, aber wie im Falle der Wundheilung, die Identität und die embryonalen Ursprungs der Fibroblasten, die mit dem Stroma der kutanen ca beitragenrcinomas nicht ausreichend definiert. Die Antwort auf diese Frage trägt medizinische Relevanz angesichts der jüngsten Studien Aussetzen des Tumor-assoziierten Fibroblasten als potenziell wirksame Ziel für Anti-Krebs-Therapie ^16.

Identifizierung und prospektiv Isolierung der Fibroblasten-Linien mit fibrogene Potenzial in vivo dotiert ist ein wesentlicher Schritt in Richtung ihrer Reaktion auf eine Verletzung in einem breiten Spektrum von akuten und chronischen Krankheitszuständen wirksam manipulieren. Im Jahr 1987 zeigte Cormack zwei Subpopulationen von Fibroblasten, einer mit Wohnsitz innerhalb der papillären und ein innerhalb der retikulären Dermis ^17,18. Eine dritte Subpopulation gefunden wurde mit Haarfollikeln in der dermalen Papille Bereich des Follikels ^19,20 verbunden. Wenn sie kultiviert werden, diese Fibroblasten-Subtypen zeigen Unterschiede in den Wachstumspotential, Morphologie und Wachstumsfaktor / Cytokine Profile ^21-24.

Bisher Studien, Fibroblasten-erterogeneity weitgehend versäumt, angemessen zu Entwicklungs- und Funktionsvielfalt bei Fibroblasten in vivo. Dies ist teilweise ein Ergebnis einer Abhängigkeit von kultivierten Fibroblastenpopulationen und das homogenisierende Wirkung Zellkultur oder eine positive Selektion auf der Grundlage eines selbst-Oberflächenrezeptor nicht von allen Fibroblasten ²⁵ ausgedrückt. Eine aktuelle Studie aus unserem Labor zeigten eine tiefgreifende Oberflächenmarker und Transkriptions-Verschiebung in kultivierten vs. uncultured Fibroblasten durch die FACS-basierte Isolierung Methodik in diesem Manuskript ²⁶ präsentiert isoliert.

Anschließend identifizierten wir eine spezifische Fibroblastenlinie innerhalb der murine dorsal Dermis und bestimmt, dass diese Linie von embryonalen Expression des Engrailed-1 definiert ist, ist in erster Linie für Bindegewebsablagerung in die Rückenhaut verantwortlich. Die Linie Funktionen während der akuten und chronischen Formen der Fibrose einschließlich Wundheilung, Krebs Stromabildung undstrahleninduzierten Fibrose ^27. Die Charakterisierung der verschiedenen Fibroblasten-Linien hat kritische Auswirkungen für Therapien, die auf die Modulation fibrogene Verhalten ausgerichtet.

Anstatt in einem der vorhandenen Protokolle, die auf In-vitro-Manipulation verlassen, um Zellisolierung ^28,29 zu erreichen, wird die Ernte-Protokoll (Abbildung 1) detailliert hier Ausbeute informative Analysen von Fibroblasten, die mehr genau zu erfassen Phänotyp und Verhalten in vivo zu helfen.