الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
الليفية هي نوع من الخلايا المسؤولة عن إفراز المبدأ المصفوفة خارج الخلية وهي عنصر حاسم في كثير من الأعضاء والأنسجة. علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الليفية تكمن وراء مجموعة من الكيانات السريرية، بما في ذلك fibroses في أجهزة متعددة، تندب الضخامي الحروق التالية، وفقدان وظيفة القلب بعد نقص التروية، وتشكيل سدى السرطان. ومع ذلك، لا تزال الخلايا الليفية نوع رديء تتميز الخلايا، إلى حد كبير بسبب عدم التجانس الكامنة. الطرق الحالية لعزل الخلايا الليفية تتطلب وقتا في الثقافة الخلية التي تؤثر تأثيرا عميقا النمط الظاهري الخلية والسلوك. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الدراسات التحقيق الليفية البيولوجيا تعتمد على التلاعب في المختبر وليس لالتقاط بدقة سلوك الخلايا الليفية في الجسم الحي. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير بروتوكول القائم على FACS لعزل الخلايا الليفية من الجلد الظهرية من الفئران الكبار التي لا تتطلب زراعة الخلايا، وبالتالي preserviنانوغرام النسخي فيزيولوجي و ملفه الشخصي البروتين من كل خلية. يسمح استراتيجيتنا لاستبعاد الأنساب غير الوسيطة عبر بوابة السلبية النسب (لين -) بدلا من استراتيجية انتقاء إيجابي لتجنب الاختيار أو تخصيب جزء من السكان من الخلايا الليفية التعبير عن علامات سطح معينة وتكون شاملة قدر الإمكان عبر هذا غير متجانسة نوع من الخلايا.
Introduction
في كثير من الأحيان يتم تعريف الخلايا الليفية شكليا باسم خلايا مغزلية الشكل التي تلتزم ركائز بلاستيكية. الليفية هي نوع من الخلايا المبدأ مسؤولة عن تجميع وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية في الجنينية والكبار الأجهزة 1. الليفية هي بالتالي حاسمة للتنمية الثدييات وتساهم إلى حد كبير في الوسط خارج الخلية التي تؤثر على سلوك أنواع الخلايا الموجودة في كل الأنسجة والأعضاء المجاورة.
الليفية هي أيضا نوع من الخلايا الرئيسي وراء مجموعة متنوعة من الظروف الطبية التي تسبب عبئا هائلا السريري. النشاط الليفية مرضية يضعف وظيفة الأنسجة الطبيعية، وتشمل الأنسجة وتليف الجهاز (مثل الرئة والكبد)، تندب التالية الجلدي التئام الجروح، وتصلب الشرايين، والتصلب الجهازي، وتشكيل لويحات التصلبية بعد إصابة الأوعية الدموية 2-5. التئام الجروح على وجه الخصوص، سمية حادة ومزمنة، ينطوي دeposition من ندبا أن لا يشبه ولا الوظائف مثل الأنسجة الطبيعية المحيطة به، ويؤدي إلى اعتلال كبير في جميع أنحاء دول مرضية مختلفة. بعد الإصابة، هناك انتقال الخلايا الليفية إلى myofibroblasts، والتي تفرز من ثم مكونات ECM الهيكلية، وتظهر الآثار نظير الصماوي على أنواع الخلايا المجاورة، واستعادة الاستقرار الميكانيكي عن طريق إيداع ندبا 6.
في الأنسجة الجلدية يوجد تفاوت كبير في نوعية إصلاح الجرح عبر الزمن التنموي وبين المواقع التشريحية. في الثلث الأولين من الحياة يشفى الجنين بدون تندب. ومع ذلك، من المرحلة الثالثة من الحمل على وطوال فترة البلوغ، والبشر شفاء مع ندبة. موقع معين، بالإضافة إلى سن معينة، والاختلافات في التئام الجروح وجود لها. جروح في تجويف الفم اعادة تشكيلها مع الحد الأدنى من تشكيل ندبة 7،8، بينما ترسب ندبا داخل الجروح الجلدية مهم 9. استمر الجدل جoncerning التأثير النسبي للبيئة مقابل الخصائص الجوهرية للالليفية المحلية على نتيجة التئام الجروح في ما يخص كلا من العمر والمكان 10،11. نظرا للاختلافات كبيرة في الشفاء من الماوس عن طريق الفم مقابل الأدمة الجلدية والجنينية السابقة (E15) مقابل في وقت لاحق الجنينية (E18) الأدمة، فمن المرجح أن الاختلافات الجوهرية في السكان من الخلايا الليفية في سن معينة التنموية وبين مختلف المواقع التشريحية وجود .
في عام 1986، افترض هارولد F. دفوراك الأورام هي الجروح التي لا تلتئم 12. اختتم دفوراك أن الأورام تتصرف مثل الجروح في الجسم وتحفز سدى من خلال تفعيل التئام الجروح استجابة المضيف. وقد حقق العديد من الدراسات منذ مساهمة الليفية في تطور سرطان 13-15، ولكن كما هو الحال في التئام الجروح، والهوية والمنشأ الجنينية من الخلايا الليفية التي تساهم في المقصورة اللحمية من كاليفورنيا الجلديةrcinomas لم يتم تعريفها على نحو كاف. الجواب على هذا السؤال يحمل أهمية الطبية نظرا الدراسات الحديثة تعريض الخلايا الليفية المرتبطة ورم كهدف محتمل فعال لعلاج مضاد للسرطان 16.
تحديد وعزل مستقبلي الأنساب الليفية هبوا إمكانية التليف في الجسم الحي هو خطوة أساسية نحو فعال التلاعب استجابتها للإصابة عبر مجموعة واسعة من الحالات المرضية الحادة والمزمنة. في عام 1987، أظهرت كورماك اثنين من مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الليفية، أحد المقيمين داخل حليمي واحد داخل الأدمة الشبكية 17،18. تم العثور على جزء من السكان الثالث المرتبطة بصيلات الشعر في المنطقة الحليمة الأدمية من 19،20 المسام. عندما مثقف، هذه الاختلافات فرعية الليفية المعرض في إمكانات النمو والصرف، وعامل النمو / السيتوكينات لمحات 21-24.
حتى الآن، ودراسات فحص الخلايا الليفية انهterogeneity فشلت إلى حد كبير لتوصيف واف التنوع التنموي وظيفية بين الخلايا الليفية في الجسم الحي. هذا هو، في جزء منه، هو نتيجة الاعتماد على السكان الليفية مثقف وتأثير المجانسة من زراعة الخلايا أو اختيار إيجابية على أساس مستقبلات سطح النفس لا التي عبر عنها جميع الخلايا الليفية 25. أظهرت دراسة حديثة من مختبرنا علامة السطحية العميقة والتحول النسخي في تربيتها مقابل الخلايا الليفية غير مثقف معزولة بسبب منهجية العزلة القائم على FACS المعروضة في هذه المخطوطة 26.
وفي وقت لاحق، حددنا نسب الخلايا الليفية معين داخل الأدمة ظهري الفئران وقرر أن هذه النسب، التي يحددها التعبير الجنينية من Engrailed-1، هو المسؤول الأول عن ترسب النسيج الضام في الجلد الظهري. وظائف النسب خلال أشكال حادة ومزمنة من التليف بما في ذلك التئام الجروح، وتشكيل سدى السرطان، والإشعاع المستحث التليف 27. توصيف سلالات الخلايا الليفية مميزة له آثار حاسمة لعلاجات تهدف إلى تحوير السلوك التليف.
بدلا من استخدام البروتوكولات الحالية التي تعتمد على التلاعب في المختبر لتحقيق زنزانة انفرادية 28،29، فإن بروتوكول الحصاد (الشكل 1) تفصيله هنا تساعد العائد التحليلات الإعلامية من الخلايا الليفية التي تستحوذ على نحو أدق النمط الظاهري والسلوك في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها في هذه المخطوطة يوفر وسيلة لعزل الخلايا الليفية عن طريق الفرز على أساس FACS، بالمقارنة مع الطرق القائمة، والتي إما تحديد لجزء من السكان أو تتطلب وقتا في ثقافة الخلية قبل التحليلات اللاحقة. الوقت اللازم من حصاد الجلد لفرز الخلايا الليفية ما يقرب من 6 ساعات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من منحة مقدمة من المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM087609 (لهبل)، وهي هدية من انغريد لاي وبيل شو تكريما لأنتوني شو (لهبل)، NIH منحة U01 HL099776 (لMTL)، ومختبر Hagey ل طب الأطفال الطب التجديدي، ومؤسسة أوك (لMTL، GCG وHPL). وأيد GGW من كلية ستانفورد للطب، وبرنامج التدريب ستانفورد عالم الطبية، ومنحة تدريبية NIGMS GM07365. وأيد ZNM من قبل جراحة التجميل مؤسسة أبحاث زمالة غرانت وصندوق الأسرة Hagey. وأيد MSH من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) زميل السريرية منحة تدريبية TG2-01159، والجمعية الأمريكية لجراحي الوجه والفكين (ASMS) / الوجه والفكين الجراحين مؤسسة (MSF) جائزة منحة بحثية، وزراعة الأنسجة وجائزة الهندسة الزمالة.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
