Summary

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Published: November 16, 2015
doi:

Summary

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

استجابة مناعية فعالة تعتمد على التعبئة السريعة من الكريات البيض في الدم إلى موقع العدوى أو الإصابة. التحقيق هجرة الكريات البيض في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي للهجرة الكريات البيض transendothelial والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية. واحد طريقة فعالة ينطوي intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.

هنا نقدم بروتوكول للحيدات التصوير والعدلات في 3 CX CR1 GFP / وزن الرابع الماوس حقن العدلات البرتقال المسمى صبغ مع مجهر متحد البؤر مقلوب. تجمع الأفلام مرور الزمن من 30 دقيقة إلى عدة ساعات من التصوير السماح للتحليل سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة على حد سواء. نحن أيضا وصف الخطوات للحث محليا الأوعية الدموية التهاب مع TLR2 / TLR1 ناهض Pam3SK4 ورصد subsequeالتوظيف الإقليم الشمالي العدلات وحيدات.

ويمكن أيضا أن تقنية قدم استخدامها لرصد الشعوب الأخرى من الكريات البيض والتحقيق جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو الاتجار باستخدام المنبهات الأخرى أو الفئران المعدلة وراثيا.

Introduction

العدلات وحيدات هي خلايا الجهاز المناعي الفطري التي تنتشر باستمرار في الدم. على الإصابة أو العدوى، وإشارات التهابات تحفز الكرية البيضاء انسلال إلى الأنسجة التالفة والمصابة، وبدء في هذه الوثيقة استجابة مناعية خلوية 1-3. سرعة تعبئة الكريات البيض تحدد نتيجة إيجابية من الاستجابات المناعية. هذه العمليات معقدة تعتمد على جزيئات محددة (على سبيل المثال، selectins، كيموكينات محددة البطانة) موجودة على البطانة الملتهبة التي تساعد على إقامة اتصالات بين لاصقة تعميم الكريات البيض والبطانة 1-3. لحصول على رؤى على جزيئات المتورطين في الكريات البيض سلسلة التوظيف، من المهم أن تصور حركية تجنيد خلية وتتبع سلوك كل خلية / السكان. ويشمل وسيلة فعالة intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.

محتوى "> وحتى الآن، وقد وضعت عدة نهج باستخدام intravital المجهري لصورة الأوعية الدموية 4،5. فعلى سبيل المثال، تم استخدام التصوير من الأدمة الأذن الأوعية الدموية أو الأوردة المساريقي بواسطة المجهر متحد البؤر حيوي داخلي لتحديد السلوك الدوريات من Ly6C الفئران حيدات منخفضة والإنسان CD14 CD16 + حيدات قاتمة على الجانب اللمعية الأوعية الدموية في ظل ظروف مستقرة 6-8. وغالبا ما يستخدم نموذج الأوعية الدموية الماوس المشمرة لرصد سلوك العدلات أو Ly6C التهابات حيدات عالية في ظل الظروف الملتهبة أو الدماغية لدى الفئران المعدلة وراثيا. وفي هذا الحالة، يتم تحفيز المشمرة عن طريق الحقن داخل الصفن من IL1β، CCL2، TNFβ أو fMLP بعد 4/2 ساعة، ثم يتم exteriorized جراحيا الأنسجة وتحليلها من قبل متحد البؤر حيوي داخلي المجهري 11/09.

يصف بروتوكول التالية طريقة لمراقبة وحيدات والعدلات في نفس الوقت مع أيمضان مقلوب المجهر متحد البؤر. وعلاوة على ذلك، تفاصيل أسلوبنا كيفية صورة السفينة نفسها قبل (حالة حالة مستقرة) وبعد الالتهاب وكيفية متابعة حركية التوظيف الكريات البيض. لهذا الغرض، ونحن نستخدم CX 3 CR1 GFP / وزن الفأر، الذي أعرب عن EGFP حيدات، والرابع حقن مع المسمى الصبغة البرتقالية العدلات الفئران. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب، فمن الممكن (1) لمتابعة وتحليل الدوريات Ly6C حيدات منخفضة في ظل ظروف مستقرة و(2) لمتابعة توظيف كل من وحيدات والعدلات في السفينة نفسها بعد التهاب المحلي. نحن هنا تهيئة الظروف التهابات باستخدام ناهض TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. وعلاوة على ذلك، يمكن لمثل هؤلاء التصوير يساعد على تحديد دور جزيئات محددة من الفائدة في مختلف مراحل سلسلة التوظيف الكريات البيض إذا أجريت على الفئران محددة الضربة القاضية، أو في وجود منع الأجسام المضادة 6،9،13.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الأخلاقية المؤسسية رعاية الحيوان في جنيف، سويسرا والمكتب البيطري كانتون: ملاحظة. إذن عدد GE / 63/14. 1. إعداد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام ال…

Representative Results

يصف المخطوطة بروتوكول الأمثل لمراقبة بسهولة سلوك حيدات والعدلات في عروق المساريقي الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي. استخدام الغرفة 37 درجة مئوية thermostated هو إلزامي للحفاظ على درجة حرارة الماوس، وكذلك نتيجة لحركة تعتمد درجة حرارة من الكريات البيض. يتم عرض إعداد الماوس في…

Discussion

المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة توفر نهجا ثابتا لدراسة الوحيدات والسلوك العدلة بكفاءة في عروق المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة.

الخطوة الحاسمة لإعداد هو الشلل في الأمعاء مع الأنسجة PBS المبللة. إذا أجريت بشكل صحيح، تتع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Materials

5 mL polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75   DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
tissue culture dish 100 TPP 93100

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).

Play Video

Cite This Article
Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

View Video