הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
תגובה חיסונית יעילה תלויה בגיוס מהיר של כדוריות דם לבנות בדם לאתר של זיהום או פציעה. חוקר הגירת יקוציט in vivo הוא חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של הגירת Transendothelial יקוציט ואינטראקציה עם האנדותל של כלי דם. גישה רבת עוצמה אחד כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.
כאן אנו מציגים פרוטוקול למונוציטים הדמיה ונויטרופילים בCX 3 iv עכבר CR1 GFP / WT הוזרק נויטרופילים שכותרתו צבע כתומים עם מיקרוסקופ confocal הפוך. זמן לשגות סרטים שנאספו מ -30 דקות לכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של התנהגות יקוציט בעורקי mesenteric תחת שני תנאי המדינה ודלקתיים יציבים. אנו גם מתארים את הצעדים כדי לגרום לדלקת בכלי דם באופן מקומי עם TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3SK4 ולפקח על subsequeגיוס NT של נויטרופילים ומונוציטים.
גם הטכניקה שהוצגה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר אוכלוסיות אחרות של לויקוציטים ולחקור מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או סחר באמצעות גירויים אחרים או עכברים מהונדסים.
Introduction
נויטרופילים ומונוציטים הם תאים של מערכת החיסון המולדת, כי כל זמן במחזור הדם. על פציעה או זיהום, אותות דלקתיים לגרום diapedesis לויקוציטים לרקמות שנפגעו ונגועים, במסמך ייזום תגובה חיסונית תאית 1-3. המהירות של גיוס לויקוציטים קובעת את התוצאה החיובית של התגובה החיסונית. תהליכים מורכבים אלה מסתמכים על מולקולות ספציפיות (למשל, selectins, כמוקינים מאוגדים האנדותל) הנוכחיות על האנדותל המודלק המסייעות להקמת קשר דבק בין כדוריות דם לבנות במחזור והאנדותל 1-3 בדי לקבל תובנות על המולקולות מעורבות ביקוציט מפל גיוס, חשוב לדמיין את קינטיקה של גיוס תא ולעקוב אחר ההתנהגות של כל תא / אוכלוסייה. שיטה יעילה כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.
תוכן "> נכון להיום, כמה גישות באמצעות מיקרוסקופ intravital פותחו לתמונה בכלי הדם 4,5. לדוגמא, הדמיה של כלי דם הדרמיס אוזן או ורידי mesenteric על ידי מיקרוסקופ confocal intravital שימשה לזהות סיור ההתנהגות של מונוציטים נמוכים Ly6C עכברי ואנושי CD14 לעמעם CD16 + מונוציטים בצד luminal של כלי דם בתנאי מצב יציבים 6-8. מודל כלי דם Cremaster העכבר משמש לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגותם של נויטרופילים או מונוציטים גבוהים Ly6C הדלקתי בתנאים דלקתיים או איסכמי בעכברים מהונדסים. שב מקרה, Cremaster מגורה באמצעות הזרקת intrascrotal של IL1β, CCL2, TNFβ או fMLP. לאחר 2-4 שעות, רקמות ואז בניתוח exteriorized ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal intravital 9-11.הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לניטור מונוציטים ונויטרופילים באותו הזמן עם כלהקרינה הפוכה מיקרוסקופ confocal. יתר על כן, השיטה שלנו מפרטת כיצד תמונה אותו כלי השיט לפני (מצב מצב יציב) ולאחר דלקת ואיך לבצע את קינטיקה של גיוס לויקוציטים. לצורך כך, אנו משתמשים 3 CR1 עכבר GFP / WT CX, מונוציטים שלהביע eGFP, הזריק IV עם נויטרופילים עכברי שכותרתו צבע כתום. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך, זה אפשרי (1) למעקב וניתוח מונוציטים הנמוכים Ly6C הסיור בתנאי מצב יציבים ו( 2) למעקב הגיוס של שני מונוציטים ונויטרופילים באותו הכלי לאחר דלקת מקומית. כאן אנו יוצרים את המצבים דלקתיים על ידי השימוש באגוניסט TLR2 / TLR1 12 Pam3CSK4. יתר על כן, הדמיה כזו עשויה לעזור לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות של עניין בשלבים השונים של מפל גיוס לויקוציטים אם בוצע על עכברי נוק-אאוט ספציפיים או בנוכחות של נוגדני חסימת 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה עקבית ללמוד ביעילות מונוציטים ונויטרופילים התנהגות בעורקי mesenteric בתנאי מדינה ודלקתית יציבים.
הצעד המכריע של ההכנה הוא חוסר תנועה של המעי עם רקמות הרטובות-PBS. אם מבוצע כראוי, כלי mesenteric ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
