Summary

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Published: November 16, 2015
doi:

Summary

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

Resposta imunitária eficaz é dependente rápida mobilização de leucócitos do sangue para o local da infecção ou lesão. Investigar a migração de leucócitos in vivo é essencial para compreender a base molecular da migração transendotelial de leucócitos e a interacção com o endotélio vascular. Uma poderosa abordagem envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.

Aqui apresentamos um protocolo para monócitos de imagem e neutrófilos no CX 3 CR1 gfp / p iv rato injetado com neutrófilos marcados com corante laranja com um microscópio confocal invertido. Filmes de lapso de tempo recolhidas a partir de 30 minutos a várias horas de imagens permitem a análise do comportamento de leucócitos nas veias mesentérica em ambas as condições estaduais e inflamatórias estáveis. Nós também descrevem os passos para induzir localmente inflamação dos vasos sanguíneos com TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 e monitorar o subsequeNT recrutamento de neutrófilos e monócitos.

A técnica apresentada pode também ser utilizado para monitorizar outras populações de leucócitos e as moléculas implicadas na investigar o recrutamento de leucócitos ou o tráfico que utilizam outros estímulos ou ratinhos transgénicos.

Introduction

Os neutrófilos e os monócitos são células do sistema imune inato que continuamente circulam no sangue. Após a lesão ou infecção, os sinais inflamatórios induzir diapedese de leucócitos em tecidos danificados e infectadas, aqui iniciar uma resposta imune celular 1-3. A rapidez da mobilização de leucócitos determina o resultado positivo das respostas imunes. Estes processos intrincados contar com moléculas específicas (por exemplo, selectinas, quimiocinas vinculado do endotélio) presentes no endotélio inflamado que ajudam para o estabelecimento de contactos adesivas entre leucócitos circulantes e do endotélio 1-3 .Para obter insights sobre as moléculas implicadas na leucócitos recrutamento cascata, é importante para visualizar a cinética do recrutamento de células e para controlar o comportamento de cada célula / população. Um método eficaz envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.

conteúdo "> Até à data, várias abordagens utilizando microscopia intravital foram desenvolvidos para a imagem da vasculatura 4,5. Por exemplo, a imagem latente da derme ou veias da orelha vasculatura mesentéricos por microscopia confocal intravital foi usada para identificar o comportamento de patrulha Ly6C murino e humano monócitos baixos CD14 dim CD16 + monócitos no lado luminal dos vasos sanguíneos sob condições de estado estacionário 6-8. O modelo de vasculatura do mouse cremaster é muitas vezes usado para monitorar o comportamento dos neutrófilos ou monócitos Ly6C inflamatória elevadas em condições inflamatórias ou isquêmicas em ratinhos transgénicos. Nesse caso, cremaster é estimulada através de injecção intrascrotal de IL1β, CCL2, TNFp ou fMLP. Depois de 4/2 hora, os tecidos são então exteriorizado e analisados ​​por microscopia confocal intravital 9-11 cirurgicamente.

O protocolo seguinte descreve um método para monitorizar monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo com qualquerinvertido de fluorescência confocal. Além disso, o nosso método fornece detalhes sobre como imagem do mesmo navio antes (condição de estado estacionário) e, após a inflamação e como seguir a cinética do recrutamento de leucócitos. Para este fim, usamos o CX 3 CR1 rato gfp / peso, cujo monócitos expressam eGFP, iv injetado com uma laranja neutrófilos murino marcadas com corante. Utilizando um microscópio invertido confocal, é possível (1) para monitorizar e analisar os monócitos patrulha Ly6C baixas sob condições de estado estacionário e (2) para seguir o recrutamento de monócitos e neutrófilos no mesmo vaso, após a inflamação local. Aqui nós criamos as condições inflamatórias usando o agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Além disso, tal imagem pode ajudar a determinar o papel de moléculas específicas de interesse nos vários passos da cascata de recrutamento de leucócitos se realizada em ratinhos knock-out específicas ou na presença de anticorpos bloqueadores 6,9,13.

Protocol

NOTA: os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética Institucional Animal Care, em Genebra, Suíça e Veterinário Cantonal. Número de autorização GE / 63/14. 1. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da medula Sacrifício rato (8-12 semanas de idade) por deslocamento cervical. Esterilizar patas traseiras com etanol 70%. Retire a pele das pernas traseiras. Dissecar fêmures e tíbias do mouse e remover o tecido de…

Representative Results

O manuscrito descreve um protocolo optimizado para controlar facilmente o comportamento dos monócitos e neutrófilos no mesentério de ratos anestesiados em tempo real. A utilização de uma câmara de 37 ° C-termostatizada é obrigatório para manter a temperatura do rato e também devido à temperatura de movimento dependentes dos leucócitos. Preparação do rato é apresentada na Figura 1. A Figura 2 mostra toda a área visto ao microscópio. Luz transmitida permite a identificaç…

Discussion

As metodologias descritas neste manuscrito fornecer uma abordagem consistente para estudar de forma eficiente monócitos e comportamento de neutrófilos nas veias mesentérica, em condições de estado estacionário e inflamatórias.

O passo crucial da preparação é a imobilização de tecidos do intestino com PBS-humedecidos. Se realizada corretamente, vasos mesentéricos são bem expostos na lamela para aquisição de imagem. Isso permite a seleção de vários domínios de interesse par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Materials

5 mL polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75   DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
tissue culture dish 100 TPP 93100

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Cite This Article
Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

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