Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d'infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire ^3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l'endothélium lié) présents sur l'endothélium enflammé qui aident à l'établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l'endothélium ^1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

contenu "> À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l'image du système vasculaire ^4,5. Par exemple, l'imagerie du derme de l'oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin ^faibles monocytes et humaine CD14 ^dim CD16 ⁺ monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d'état d'équilibre ^{de 6-8.} Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire ^élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale ^9-11.

Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l'image du même navire avant (d'état d'équilibre) et après l'inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX ₃ CR1 souris ^{GFP / poids,} dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C ^faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l'agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 ^12. En outre, comme l'imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d'intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d'anticorps bloquants ^6,9,13.