La diferenciación de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano

La capacidad de utilizar en sistemas de modelos in vitro ha mejorado en gran medida el campo de la neurobiología y las neurociencias. Las células en cultivo proporcionan una plataforma eficiente para caracterizar la funcionalidad de las proteínas y los mecanismos moleculares subyacentes fenómenos específicos, para entender la patología de la enfermedad y la infección, y para realizar evaluaciones preliminares de análisis de drogas. En la neurobiología, los principales tipos de modelos de cultivo celular incluyen cultivos neuronales primarios derivados de ratas y ratones, y las líneas celulares de neuroblastoma, tales como células B35 de la rata ^5, Neuro-2A células de ratón ^6, y las células PC12 de rata ^7. Aunque el uso de tales líneas de células ha avanzado de manera significativa el campo, hay varios factores de confusión asociadas con la manipulación de las células y tejidos no humanos. Estos incluyen especies específicas de comprensión de las diferencias en los procesos metabólicos, fenotipos de manifestación de la enfermedad, y la patogénesis en comparación con los seres humanos. También es importante tener en cuenta que lare son diferencias significativas entre el ratón y la expresión de genes humanos y de señalización del factor de transcripción, destacando las limitaciones de los modelos de roedores y la importancia de comprender las vías que se conservan entre roedores y humanos ^8-11. Otros han empleado el uso de líneas de células neuronales humanas, incluyendo la N-Tera-2 (NT2) línea celular humana teratocarcinoma y células madre pluripotentes inducibles (CMPI). Estas líneas celulares proporcionan buenos modelos para sistemas humanos in vitro. Sin embargo, la diferenciación de las células NT2 con ácido retinoico (RA) da como resultado la generación de una población mixta de neuronas, astrocitos y células gliales radiales ^12, requiriendo una etapa de purificación adicional para obtener poblaciones puras de las neuronas. Además, las células NT2 demuestran un cariotipo muy variable ^13, con más de 60 cromosomas en 72% de las células. iPSCs demuestran la variabilidad en la diferenciación entre las diferentes líneas celulares y varían en la eficiencia de la diferenciación ^14. Por lo tanto, es deseable tener un modelo de célula neuronal humano consistente y reproducible para complementar estas alternativas.

células de neuroblastos-como SH-SY5Y son un subclón de la línea celular de neuroblastoma padres SK-N-SH. La línea celular parental se generó en 1970 a partir de una biopsia de médula ósea que contiene tanto células de tipo epitelial ¹⁵ neuroblastos-como y. células SH-SY5Y tienen un cariotipo estable que consta de 47 cromosomas, y se pueden diferenciar de un estado neuroblast-como en neuronas humanos maduros a través de una variedad de diferentes mecanismos que incluyen el uso de RA, ésteres de forbol, y neurotrofinas específicos, tales como derivados de cerebro factor neurotrófico (BDNF). Antes evidencia sugiere que el uso de diferentes métodos puede seleccionar para los subtipos de neuronas específicas, tales como adrenérgicos, colinérgicos, y las neuronas dopaminérgicas ^16,17. Este último aspecto hace que las células SH-SY5Y útiles para una multitud de experimentos neurobiología.

ONTENIDO "> Varios estudios han señalado importantes diferencias entre las células SH-SY5Y en sus estados no diferenciadas y diferenciadas. Cuando las células SH-SY5Y son indiferenciada, rápidamente proliferan y parecen ser no polarizado, con muy pocos procesos, cortos. A menudo crecen en grupos y expresar marcadores indicativos de las neuronas inmaduras ^18,19. Cuando diferenciadas, estas células se extienden largas, ramificado procesos, disminución en la proliferación y, en algunos casos polarizan ^2,18. SH-SY5Y células completamente diferenciadas se han demostrado previamente para expresar una variedad de diferentes marcadores de las neuronas maduras incluyendo la proteína asociada al crecimiento (GAP-43), los núcleos neuronales (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína de la vesícula II (SV2), enolasa neuronal específica (NSE) y la proteína asociada a microtúbulos (MAP) ^2,16,17,20, y carecer de la expresión de marcadores gliales tales como la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) ^4. En apoyo que diferencian SH-SY5Y células represent una población neuronal homogénea, la eliminación de BDNF da como resultado la apoptosis celular ^4. Esto sugiere que la supervivencia de las células SH-SY5Y diferenciadas depende de factores tróficos, similares a neuronas maduras.

El uso de células SH-SY5Y se ha incrementado desde el subclón fue establecida en 1978 ^3. Algunos ejemplos de su uso incluyen la investigación de la enfermedad de Parkinson ^17, enfermedad de Alzheimer ^21, y la patogénesis de la infección viral, por ejemplo poliovirus ^22, el enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , virus de la varicela-zoster (VZV) ^1, citomegalovirus humano ^25, y el virus de herpes simplex (HSV) ^2,26. Es importante tener en cuenta que varios estudios utilizando células SH-SY5Y han utilizado estas células en su forma no diferenciada, especialmente en el campo de la Neurovirology ^27-36. La diferencia en el fenotipo observado de no diferenciado frente a las células SH-SY5Y diferenciadas plantea la cuestión de wheTher la progresión observada de infección sería diferente en las neuronas diferenciadas maduras. Por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas tienen una mayor eficiencia de HSV-1 absorción frente a, la proliferación de células SH-SY5Y diferenciadas, que pueden ser debido a la falta de receptores de superficie que se unen HSV y modulan la entrada en las células SH-SY5Y diferenciadas ^2. Por tanto, es fundamental que en el diseño de un experimento se centró en las pruebas de neuronas in vitro, las células SH-SY5Y se deben diferenciar el fin de obtener los resultados más precisos para la traducción y la comparación con los modelos in vivo.

El desarrollo de un método fiable para generar cultivos neuronales humanos es imprescindible para permitir a los investigadores realizar experimentos de traslación que modelan con precisión el sistema nervioso humano. El protocolo que se presenta aquí es un procedimiento que delinea mejores prácticas derivadas de los métodos anteriores ^1-4 para enriquecer en neuronas humanas que se diferencianutilizando ácido retinoico.