A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

A capacidade de utilizar em sistemas modelo in vitro melhorou substancialmente nos domínios da neurobiologia e as neurociências. Células em cultura fornecer uma plataforma eficiente para caracterizar a funcionalidade de proteínas e mecanismos moleculares subjacentes fenômenos específicos, para entender a patologia de doenças e infecções, e para realizar avaliações preliminares de testes de drogas. In Neurobiology, os principais tipos de modelos de culturas de células neuronais primárias incluem culturas derivadas de ratos e murganhos, e linhas celulares de neuroblastoma, tais como células B35 de rato ^5, Neuro-2A ^6, células de rato, e células PC12 de rato ^7. Embora a utilização de tais linhas celulares tem avançado de forma significativa do campo, há vários factores de confusão associados com a manipulação de células e de tecidos não-humanos. Estes incluem espécies específicas compreender as diferenças nos processos metabólicos, fenótipos de manifestação da doença e patogênese quando comparado aos seres humanos. É também importante notar que are diferenças significativas entre mouse e expressão do gene humano e sinalização fator de transcrição, destacando as limitações dos modelos de roedores e a importância de compreender as vias metabólicas que são conservadas entre roedores e humanos ^8-11. Outros têm utilizado o uso de linhas de células neuronais humanos, incluindo o N-Tera-2 (NT2), linha celular de teratocarcinoma humano e células estaminais pluripotentes indutíveis (iPSCs). Estas linhas celulares fornecem bons modelos para sistemas in vitro humanos. No entanto, a diferenciação de células NT2 com ácido retinóico (RA) resulta na geração de uma população mista de neurónios, astrócitos e células gliais radiais ^12, que necessitam de um passo de purificação adicional para obtenção de populações puras de neurónios. Além disso, as células NT2 demonstrar um cariótipo altamente variável ^13, com maior do que 60 cromossomas em 72% das células. iPSCs demonstram a variabilidade na diferenciação entre as diferentes linhas de células e diferenciação variar em eficiência ^14. Por conseguinte, é desejável ter um modelo celular neuronal humana consistente e reprodutível para complementar estas alternativas.

SH-SY5Y células neuroblastos-like são um subclone da linha celular de neuroblastoma parentais SK-N-SH. A linha de células parental foi gerado em 1970 a partir de uma biópsia de medula óssea que contém as células epiteliais do tipo ^{15-neuroblastos} como e. As células SH-SY5Y ter um cariótipo estável que consiste de 47 cromossomas, e podem ser diferenciados a partir de um estado de neuroblastos-como em neurónios humanos maduros através de uma variedade de diferentes mecanismos, incluindo o uso de AR, ésteres do forbol, e neurotrofinas específicas, tais como cérebro-derivado factor neurotrófico (BDNF). Antes evidência sugere que a utilização de diferentes métodos podem seleccionar para os subtipos de neurónios adrenérgicos específicos, tais como, colinérgico, e neurónios dopaminérgicos ^16,17. Este último aspecto torna as células SH-SY5Y úteis para uma variedade de experiências de neurobiologia.

onteúdo "> Vários estudos notaram diferenças importantes entre as células SH-SY5Y em seus estados indiferenciados e diferenciadas. Quando as células SH-SY5Y são indiferenciadas, eles rapidamente proliferar e parecem ser não-polarizada, com muito poucos processos, curtos. Eles geralmente crescem em aglomerados e expressam marcadores de neurónios imaturos indicativos ^18,19. Quando diferenciadas, estas células estender ramificada longa processos, a diminuição da proliferação e, em alguns casos polarizar ^2,18. As células SH-SY5Y completamente diferenciadas foram anteriormente demonstrado para expressar um variedade de diferentes marcadores de neurónios maduros incluindo proteína associada ao crescimento (GAP-43), núcleos neuronais (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína vesicular II (SV2), a enolase específica neuronal (NSE) e microtúbulos proteína associada (MAP) ^2,16,17,20, e a falta de expressão de marcadores gliais, tais como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) ^4. Em mais apoio diferenciadas que as células SH-SY5Y represeNT uma população neuronal homogénea, a remoção de BDNF resulta em apoptose celular ^4. Isto sugere que a sobrevivência de células SH-SY5Y diferenciadas é dependente de factores tróficos, semelhantes a neurónios maduros.

Utilização de células SH-SY5Y aumentou desde o subclone foi estabelecida em 1978 ^3. Alguns exemplos da sua utilização incluem a investigação da doença de Parkinson ^17, a doença de Alzheimer ^21, e a patogénese da infecção virai, incluindo poliovírus ^22, enterovírus 71 (EV71) ^23,24 , vírus da varicela-zoster (VZV) ^1, citomegalovírus humano ^25, e vírus do herpes simplex (HSV) ^2,26. É importante notar que diversos estudos utilizando células SH-SY5Y foram utilizadas estas células na sua forma indiferenciada, especialmente no campo da neurovirology ^27-36. A diferença no fenótipo observado de indiferenciada contra células SH-SY5Y diferenciadas levanta a questão de wheterap a progressão da infecção observada seria diferente em neurónios diferenciados maduros. Por exemplo, as células SH-SY5Y diferenciadas têm uma maior eficiência de HSV-1 captação versus, em proliferação células SH-SY5Y indiferenciadas, que pode ser devido a uma falta de receptores de superfície que ligam o HSV e modulam a entrada em indiferenciadas células SH-SY5Y ^2. Portanto, é fundamental que ao projetar um experimento voltado a testar os neurônios in vitro, as células SH-SY5Y deve ser diferenciada a fim de obter os resultados mais precisos para a tradução e comparação de modelos in vivo.

O desenvolvimento de um método confiável para gerar culturas neuronais humanos é imperativo para permitir que os investigadores para realizar experimentos tradução que modelar com precisão o sistema nervoso humano. O protocolo aqui apresentado é um processo que delineia as melhores práticas derivadas de métodos anteriores ^1-4 para o enriquecimento em neurónios humanos que são diferenciadosutilizando ácido retinóico.