La différenciation de la SH-SY5Y neuroblastome humain Cell Line

La possibilité d'utiliser dans des systèmes modèles in vitro a grandement amélioré les domaines de la neurobiologie et les neurosciences. Cellules en culture constituent une plate-forme efficace pour caractériser la fonctionnalité des protéines et des mécanismes moléculaires spécifiques phénomènes sous-jacents, de comprendre la pathologie de la maladie et l'infection, et d'effectuer des évaluations préliminaires de dépistage de drogues. En neurobiologie, les principaux types de modèles de culture de cellules comprennent des cultures de neurones primaires dérivées de rat et la souris, et des lignées cellulaires de neuroblastome comme les cellules B35 de rat ^5, des cellules de souris Neuro-2A ^6, et les cellules PC12 de rat ^7. Bien que l'utilisation de telles lignées cellulaires a progressé de façon significative le champ, il existe plusieurs facteurs de confusion liés à la manipulation des cellules non humaines et des tissus. Ceux-ci comprennent la compréhension spécifiques aux espèces différences dans les processus métaboliques, les phénotypes de la manifestation de la maladie, et la pathogenèse par rapport à l'homme. Il est également important de noter que lere des différences significatives entre la souris et l'expression de gènes humains et de la signalisation du facteur de transcription, en soulignant les limites des modèles de rongeurs et l'importance de comprendre quelles voies sont conservées entre les rongeurs et les humains ^8-11. D'autres ont eu recours à l'utilisation de lignées de cellules neuronales humaines, y compris la N-Tera-2 (NT2) de lignée humaine de cellules de tératocarcinome et cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi). Ces lignées cellulaires sont de bons modèles pour systèmes humains in vitro. Toutefois, la différenciation des cellules NT2 avec de l'acide rétinoïque (RA) a pour résultat la génération d'une population mixte de neurones, les astrocytes et les cellules gliales radiales ^12, ce qui nécessite une étape de purification supplémentaire afin d'obtenir des populations pures de neurones. En outre, les cellules NT2 montrent un caryotype très variable ^13, avec plus de 60% ​​en 72 chromosomes des cellules. iPSCs montrent la variabilité dans la différenciation entre les différentes lignées cellulaires et de modification de l'efficacité de la différenciation ^14. Il est donc souhaitable de disposer d'un modèle cellulaire neuronale humaine constante et reproductible pour compléter ces alternatives.

cellules neuroblastes comme SH-SY5Y sont un sous-clone de la lignée de cellules de neuroblastome parentale SK-N-SH. La lignée cellulaire parentale a été généré en 1970 à partir d'une biopsie de la moelle osseuse qui contient à la fois neuroblastes-like et les cellules épithéliales de type ^15. SH-SY5Y ont un caryotype stable constitué de 47 chromosomes, et peuvent être différenciés d'un état dans les neurones humains matures neuroblastes comme à travers une variété de mécanismes, y compris l'utilisation de la PR, les esters de phorbol et neurotrophines spécifiques tels que les brain-derived facteur neurotrophique (BDNF). Avant preuve suggère que l'utilisation de différentes méthodes peut sélectionner des sous-types spécifiques de neurones adrénergiques tels que, cholinergiques et des neurones dopaminergiques ^16,17. Ce dernier aspect fait SH-SY5Y utiles pour une multitude d'expériences de la neurobiologie.

ontenu "> Plusieurs études ont noté des différences importantes entre les cellules SH-SY5Y dans leurs états indifférenciées et différenciées. Lorsque les cellules SH-SY5Y sont indifférenciées, elles prolifèrent rapidement et semblent être non polarisée, avec très peu, des processus courts. Ils poussent souvent en touffes et d'exprimer des marqueurs indicatifs de neurones immatures ^18,19. Lorsque différencié, ces cellules étendent longs processus ramifié, diminution de la prolifération et, dans certains cas polarisent ^2,18. SH-SY5Y différenciées ont été entièrement précédemment démontré pour exprimer une variété de différents marqueurs de neurones matures, y compris des protéines de croissance associé (GAP-43), les noyaux neuronaux (NeuN), la synaptophysine (SYN), synaptique protéine vésiculaire II (SV2), neurone énolase spécifique (NSE) et la protéine associée aux microtubules (MAP) ^2,16,17,20 et à l'absence d'expression de marqueurs gliales telles que protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ^4. En outre soutien qui différencient SH-SY5Y represent une population neuronale homogène, l'enlèvement de BDNF se traduit par l'apoptose cellulaire ^4. Ceci suggère que la survie des cellules SH-SY5Y différenciées dépend de facteurs trophiques, semblables à des neurones matures.

L'utilisation de cellules SH-SY5Y a augmenté depuis le sous-clone a été créé en 1978 ^3. Quelques exemples de leur utilisation comprennent l'investigation de la maladie de Parkinson ^17, la maladie d'Alzheimer ^21, et la pathogenèse de l'infection virale dont poliovirus ^22, l'entérovirus 71 (EV71) ^23,24 , le virus varicelle-zona (VZV), ^{1, 25} cytomégalovirus humain et le virus de l'herpès simplex (HSV) ^2,26. Il est important de noter que plusieurs études utilisant des cellules SH-SY5Y ont utilisé ces cellules dans leur forme indifférenciée, en particulier dans le domaine de la neurovirologie ^27-36. La différence dans le phénotype observé des indifférenciée par rapport aux cellules SH-SY5Y différenciées soulève la question de whether la progression observée de l'infection serait différent dans les neurones différenciés matures. Par exemple, des cellules SH-SY5Y différenciées ont une plus grande efficacité de HSV-1 absorption en fonction, la prolifération des cellules SH-SY5Y indifférenciées, qui peuvent être dus à un manque de récepteurs de surface qui se lient HSV et modulent entrée sur les cellules SH-SY5Y indifférenciées ^2. Il est donc essentiel que lors de la conception d'une expérience axé sur les essais neurones in vitro, les cellules SH-SY5Y devraient être différenciés afin d'obtenir les résultats les plus précis pour la traduction et la comparaison avec des modèles in vivo.

Le développement d'une méthode fiable pour générer des cultures de neurones humains est impératif de permettre aux chercheurs de réaliser des expériences traductionnelles modéliser avec précision le système nerveux humain. Le protocole présenté ici est une procédure qui définit les meilleures pratiques issues de méthodes précédentes ^1-4 pour enrichir les neurones humains qui se différencientavec de l'acide rétinoïque.