Summary

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Published: February 17, 2016
doi:

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

القدرة على استخدام نظم نموذج المختبر عزز كثيرا من مجالات علم الأعصاب وعلم الأعصاب. الخلايا في الثقافة بمثابة منصة فعالة لتوصيف وظيفة البروتين والآليات الجزيئية الظواهر المحددة الأساسية، لفهم علم الأمراض من الأمراض والعدوى، وإجراء عمليات تقييم اختبار المخدرات الأولية. في علم الأعصاب، وأنواع رئيسية من نماذج ثقافة الخلية تشمل الثقافات العصبية الأولية المستمدة من الجرذان والفئران، وخطوط الخلايا العصبية مثل خلايا الفئران B35 العصبية-2A خلايا فأر وخلايا الفئران PC12 7. على الرغم من أن استخدام خطوط الخلايا مثل هذه تقدمت مجال كبير، وهناك عدة عوامل خارجية مرتبطة التعامل مع الخلايا غير والأنسجة البشرية. وتشمل هذه الأنواع المحددة فهم الاختلافات في عمليات التمثيل الغذائي، الظواهر من مظاهر المرض، والتسبب بالمقارنة مع البشر. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنإعادة اختلافات كبيرة بين الماوس والتعبير الجيني البشري وعامل النسخ الإشارات، وتسليط الضوء على القيود المفروضة على نماذج القوارض وأهمية التفاهم التي تم حفظها الممرات بين القوارض والبشر 8-11. ويعمل آخرون على استخدام خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك N-تيرا-2 (NT2) خط البشري خلية سرطانة مسخية والخلايا الجذعية المحفزة محرض (iPSCs). هذه خطوط الخلايا توفر نماذج جيدة لفي المختبر النظم البشرية. ومع ذلك، تمايز الخلايا NT2 مع حمض الريتينويك (RA) النتائج في توليد يسكنها خليط من الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية شعاعي 12، مما استلزم خطوة تنقية إضافية للحصول على مجموعات نقية من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا NT2 يبرهن على وجود النمط النووي متغير بدرجة كبيرة 13، مع أكثر من 60 الكروموسومات في 72٪ من الخلايا. iPSCs تظهر التباين في التفريق بين خطوط مختلفة من الخلايا وتتفاوت في كفاءة التمايز 14، وبالتالي من المستحسن أن يكون نموذجا الخلايا العصبية البشرية متسقة وقابلة للتكرار لتكمل هذه البدائل.

SH-SY5Y خلايا تشبه أرومة عصبية هي subclone من الوالدين خط الخلية العصبية SK-N-SH. تم إنشاء خط الخلية الوالدية في عام 1970 من خزعة نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا تشبه الخلايا الظهارية 15 على حد سواء مثل أرومة عصبية و. الخلايا SH-SY5Y لديها النمط النووي مستقرة تتكون من 47 كروموسوم، ويمكن أن تكون متباينة من دولة مثل أرومة عصبية إلى الخلايا العصبية البشرية الناضجة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المختلفة بما في ذلك استخدام RA، استرات phorbol، وneurotrophins محددة مثل المستمدة الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF). وتشير الأدلة السابقة أن استخدام أساليب مختلفة يمكن اختيار لفرعية الخلايا العصبية محددة مثل الأدرينالية، الكوليني، والخلايا العصبية الدوبامين 16،17. هذا الجانب الأخير يجعل الخلايا SH-SY5Y مفيدة للعديد من التجارب علم الأعصاب.

ontent "> وقد لاحظ العديد من الدراسات اختلافات هامة بين الخلايا SH-SY5Y في ولاياتهم غير متمايزة ومتباينة، وعندما الخلايا SH-SY5Y هي غير متمايزة، فإنها تتكاثر بسرعة، ويبدو أن غير مستقطب، مع عدد قليل جدا من العمليات، قصيرة. وغالبا ما تنمو في كتل والتعبير عن علامات تدل على الخلايا العصبية غير ناضجة 18،19. وعندما متباينة، وهذه الخلايا تمتد طويلا، تشعبت العمليات، وانخفاض في انتشار، وفي بعض الحالات استقطاب 2،18. تم الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما أثبتت سابقا للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مختلفة من الخلايا العصبية الناضجة بما في ذلك البروتين المرتبط النمو (GAP-43)، نوى الخلايا العصبية (NeuN)، synaptophysin (SYN)، متشابك بروتين حويصلة الثاني (SV2)، الخلايا العصبية إينولاز معين (NSE) وأنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2،16،17،20، وتفتقر إلى التعبير عن علامات الدبقية مثل ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) (4). وفي مزيد من الدعم الذي يميز الخلايا SH-SY5Y represeالإقليم الشمالي يبلغ عدد سكانها العصبية متجانسة، وإزالة عامل التغذية العصبية نتائج في الخلايا الخلوية (4). هذا يشير إلى أن بقاء الخلايا SH-SY5Y متباينة تعتمد على العوامل الغذائية، مماثلة إلى أن تنضج الخلايا العصبية.

وقد ازداد استخدام الخلايا SH-SY5Y منذ تأسيس subclone في عام 1978 3. وتشمل بعض الأمثلة على استخدامها يحقق مرض باركنسون 17 ومرض الزهايمر 21، والتسبب في العدوى الفيروسية بما في ذلك فيروس شلل الأطفال 22، الفيروس المعوي 71 (EV71) 23،24 وفيروس الحماق النطاقي (جدري الماء) 1، والفيروس المضخم للخلايا الإنسان 25، وفيروس الهربس البسيط (HSV) 2،26. من المهم أن نلاحظ أن العديد من الدراسات باستخدام الخلايا SH-SY5Y وقد استخدمت هذه الخلايا في شكلها غير متمايز، وخاصة في مجال neurovirology 27-36. الاختلاف في النمط الظاهري الملحوظ من غير متمايزة مقابل الخلايا SH-SY5Y متباينة يثير مسألة عرجذر التقدم لوحظ من العدوى ستكون مختلفة في الخلايا العصبية متباينة ناضجة. على سبيل المثال، متباينة الخلايا SH-SY5Y لها كفاءة أعلى من HSV-1 امتصاص مقابل غير متمايزة، تكاثر الخلايا SH-SY5Y، والذي قد يكون نتيجة لعدم وجود مستقبلات سطح التي تربط HSV وتعدل الدخول على غير متمايزة خلايا SH-SY5Y 2. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن عند تصميم تجربة تركز على اختبار الخلايا العصبية في المختبر، ينبغي التمييز بين الخلايا SH-SY5Y من أجل الحصول على أدق النتائج للترجمة وبالمقارنة مع النماذج في الجسم الحي.

تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد الثقافات العصبية الإنسان أمر حتمي السماح للباحثين لإجراء تجارب متعدية هذا النموذج بدقة الجهاز العصبي البشري. بروتوكول المقدمة هنا هو الإجراء الذي يحدد أفضل الممارسات المستمدة من الطرق السابقة 1-4 لإثراء لالخلايا العصبية البشرية التي متباينةاستخدام حمض الريتينويك.

Protocol

1. اعتبارات عامة انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة من الكواشف اللازمة. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة صارمة. استخدام الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (hiFBS) لجميع الاستعدادا…

Representative Results

في الوقت الحاضر، هناك العديد من الحالات في مجال علم الأعصاب وneurovirology حيث يتم استخدام الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة كنموذج عملي لالخلايا العصبية البشرية 27-36، والأهم من ذلك، خلايا غير متمايزة قد تفتقر الظواهر مثل الأمثل امتصاص الفيروسي 2 التي هي ضرورة التفسير ال…

Discussion

وينص البروتوكول أعلاه طريقة واضحة وقابلة للتكرار لتوليد الخلايا العصبية الثقافات البشرية متجانسة وقابلة للحياة. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات والممارسات التي تدمج العديد من الطرق التي نشرت سابقا 1-4 والأهداف لتحديد أفضل الممارسات من كل. تمايز الخلايا SH-SY5Y يع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

Materials

B-27 Invitrogen 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061
Glutamine Hyclone SH30034.01
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054
Falcon 35mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001

References

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -. T., Lau, W. K. -. W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
  24. Xu, L. -. J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -. I., Song, B. -. H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -. N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Play Video

Cite This Article
Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

View Video