בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה
Summary
It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Abstract
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Introduction
היכולת להשתמש במערכות מודל במבחנה שיפרה מאוד בתחומי נוירוביולוגיה מדעי המוח. תאים בתרבית לספק פלטפורמה יעילה לאפיין פונקציונליות חלבון מנגנונים מולקולרי תופעות ספציפיות בסיסיות, להבין את הפתולוגיה של מחלות וזיהומים, וכדי לבצע הערכות בדיקות סמים ראשוניות. בנוירוביולוגיה, הסוגים העיקריים של מודלי תרבית תאים כוללים תרבויות עצביות עיקריות נגזרו חולדות ועכברים, שורות תאי נוירובלסטומה כגון תאי העכברוש B35 5, בתאים עכבר נוירו-2A 6, ותאי PC12 עכברוש 7. למרות השימוש של שורות תאים כאלה התקדמה בתחום מזה, אך קיימים מספר גורמים מבלבלים הקשורים בטיפול הלא-אנושי תאים ורקמות. אלה כולל מינים ספציפי הבנת הבדלים בתהליכי חילוף חומרים, פנוטיפים של ביטוי מחלה, בפתוגנזה בהשוואה לבני אדם. כמו כן, חשוב לציין כימחדש הבדלים משמעותיים בין עכבר ביטוי גנים אנושיים ואיתות גורם שעתוק, המדגישות את המגבלות של מודלים מכרסמים ואת החשיבות של הבנה אשר מסלולים שמורה בין מכרסמים ובני אדם 8-11. אחרים המועסקים השימוש של שורות תאים עצביים האנושי כולל N-Tera-2 (NT2) בקו האנושי teratocarcinoma התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה (iPSCs). שורות תאים אלה מספקים מודל טוב במבחנת מערכות אדם. עם זאת, התמיינות של תאי NT2 עם חומצה רטינואית (RA) תוצאות בדור של אוכלוסייה המעורבת של נוירונים, האסטרוציטים, ותאי גלייה רדיאלי 12, דבר מחייב צעד טיהור נוסף כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של נוירונים. בנוסף, תאי NT2 להפגין קריוטיפ משתנה מאוד 13, עם יותר מ -60 כרומוזומים 72% של תאים. iPSCs להפגין השתנות בידול בין שורות תאים שונות, ונבדלים זה מזה יעיל בידול 14. לכן רצוי שיהיה מודל תאים עצבי אדם עקבי לשחזור כדי להשלים חלופות אלה.
SH-SY5Y תאים דמויי neuroblast הם subclone של הקו הסלולרי נוירובלסטומה הורית SK-N-SH. שורת תא ההורים נוצרה בשנת 1970 מתוך ביופסית מח עצם המכיל את שני neuroblast דמוי תאים דמויים אפיתל 15. יש תאי SH-SY5Y קריוטיפ יציב המורכב של 47 כרומוזומים, והוא יכול להיות מובחן ממצב neuroblast הדמוי אל הנוירונים שמהם מתפתחים שורה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים שונים כולל שימוש RA, אסטרים phorbol, ו neurotrophins הספציפי כגון מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF). ראיות לפני עולה כי שימוש בשיטות שונות ניתן לבחור עבור תת נוירונים ספציפיים כגון אדרנרגיים, כולינרגית, ו נוירונים דופאמינרגיים 16,17. ההיבט השני הזה גורם לתאי SH-SY5Y שימושי עבור מספר רב של ניסויים לנוירוביולוגיה.
ontent "> מספר מחקרים הראו ההבדלים חשובים בין תאי SH-SY5Y במדינות המובחנות בדיל שלהם. כאשר תאי SH-SY5Y הם מובחנים, הם מתרבים במהירות להיראות בלתי מקוטב, עם מעט מאוד, תהליכים קצרים. הם לרוב גדלים בגושים ולהביע סמנים המעידים על נוירונים בשלה 18,19. כאשר בדיל, תאים אלה להאריך ארוכים, מסועפים תהליכים, ירידה בהתרבות, ובמקרים מסוימים לקטב 2,18. תאי SH-SY5Y בדיל באופן מלא כבר הוכיחו בעבר להביע מגוון של סמנים שונים של נוירונים בוגרים לרבות גידול הקשורים החלבון (GAP-43), גרעינים עצביים (NeuN), synaptophysin (SYN), הסינפטי שלפוחית חלבון II (SV2), נוירון אנולאז ספציפי (NSE) ו microtubule הקשורים החלבון (MAP) 2,16,17,20, ואת חוסר ביטוי של סמנים גליה כגון חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) 4. ב תמיכה נוספת שהבדילו SH-SY5Y תאים represeNT אוכלוסייה עצבית הומוגנית, הסרת BDNF התוצאה הסלולר אפופטוזיס 4. הדבר מצביע על כך ששיעור ההישרדות של תאי SH-SY5Y בדיל תלוי בגורמים תזונתיים, בדומה להבשיל נוירונים.השימוש בתאי SH-SY5Y גדל מאז subclone הוקם בשנת 1978 3. כמה דוגמאות של השימוש שלהם כוללות חוקרת מחלת פרקינסון 17, מחלת אלצהיימר 21, ו בפתוגנזה של זיהום ויראלי כולל poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 אבעבועות רוח, שלבקת חוגרת, וירוס (VZV) 1, ציטומגלווירוס אדם 25, ו נגיף הרפס סימפלקס (HSV) 2,26. חשוב לציין כי מספר מחקרים באמצעות תאי SH-SY5Y השתמשו בתאים אלה בצורתם המובחנת, במיוחד בתחום neurovirology 27-36. ההבדל הפנוטיפ הנצפה של מובחן לעומת תאי SH-SY5Y בדיל מעלה את שאלת wheיס את התקדמות הזיהום נצפה יהיה שונה נוירונים בדיל בוגרים. לדוגמה, תאים SH-SY5Y הבדיל יש יעילות גבוהה יותר של ספיגת HSV-1 לעומת תאים שלא עברו התמיינות, SH-SY5Y מתרבים, אשר יכול להיות בגלל חוסר הקולטנים אשר נקלטות HSV ולווסת הכניסה על תאים SH-SY5Y מובחן 2. לכן זה קריטי כי בעת תכנון ניסוי התמקד בבדיקת נוירונים במבחנה, תאים SH-SY5Y צריך להיות מובחן על מנת לקבל את התוצאות המדויקות ביותר עבור תרגום השוואה למודלים in vivo.
פיתוח שיטה אמינה לייצר תרביות נוירונים אדם הוא הכרחי כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניסויי translational במדויק מודל מערכת עצבים אנושי. הפרוטוקול המובא כאן הוא הליך תוחם מומלצים נגזר שיטות קודמות 1-4 להעשיר נוירונים אדם נחלקיםבאמצעות חומצה רטינואית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול לעיל מספק שיטה פשוטה לשחזור כדי ליצור תרביות נוירונים אדם הומוגנית ובת קיימא. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ושיטות עבודה המשלבים מספר שיטות שפורסמו בעבר 1-4 ומטרתה להתוות את שיטות העבודה המומלצות של כל אחד. התמיינות של תאי SH-SY5Y מסתמכים על קיפוח בסרום הדרגת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
Materials
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | – |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
| Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -. T., Lau, W. K. -. W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -. J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -. I., Song, B. -. H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -. N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
