Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

Herpes simplex virus (HSV) può causare una serie di malattie negli esseri umani da lievi lesioni mucocutanee semplici alle infezioni pericolose per la vita. HSV di tipo 1 (HSV-1) è prevalentemente associata a infezioni orofacciale e l'encefalite, mentre HSV di tipo 2 (HSV-2) più probabile causa di infezioni genitali ^1. Mentre non vi è un progresso significativo nella comprensione di come HSV entra nelle cellule in coltura, avvia l'infezione e produce progenie virale, sappiamo poco del percorso virale invasione (s) nel tessuto a livello cellulare ^2. Per gli studi di HSV infezioni della pelle o della mucosa, topi, conigli e cavie sono stati utilizzati come modelli animali. Infezione della pelle è stato istituito con iniezione intradermica o graffiare la pelle in presenza del virus, e lo sviluppo della malattia è stata correlata con la produzione di virus. Questi metodi hanno aiutato a comprendere vari aspetti della patogenesi della malattia, e sono utilizzate per valutare farmaci antivirali. Per studiare infezione da HSV al tissue livello, sono stati applicati modelli organotipica di pelle umana. Poiché il tasso di infezione è limitato in queste culture zattera, solo un numero limitato di studi che hanno valutato l'infezione, diffusione virale e gli effetti dei componenti antivirali sono stati pubblicati ^3-6.

Al fine di caratterizzare i determinanti cellulari che svolgono un ruolo durante HSV-1 nell'epitelio intatto, abbiamo stabilito un protocollo per la ex vivo studi infezioni dell'epidermide murini ^7. Pelle è stato preparato da neonati o dalle code di topi adulti. Dal momento che HSV-1 non è riuscito a infettare campioni di pelle completi, che sono stati immersi in mezzo contenente il virus, abbiamo separato l'epidermide dal derma da dispasi trattamento II. Dopo variabile dei fogli epidermica su terreno contenente il virus, cellule infettate possono essere visualizzati nello strato epidermico basale in vari momenti postinfection (pi) ^7. Per visualizzare l'inizio di infezione in cellule singole prima replica virale unnd produzione di virus, abbiamo macchiato con un anticorpo contro la proteina delle cellule infettate 0 (ICP0), che è una delle prime proteine ​​espresse durante HSV-1. La localizzazione cellulare di ICP0 passa attraverso fasi distinte durante l'infezione precoce. Mentre ICP0 è presente in foci nucleari in una fase precoce di espressione genica virale, rilocalizzazione di ICP0 al citoplasma indica una successiva fase di infezione ^8.

Abbiamo usato la ex vivo di infezione test di fogli epidermica da diversi modelli murini per testare il potenziale ruolo di diversi fattori cellulari durante l'infezione. Per affrontare l'impatto di Rac1 come un regolatore chiave delle dinamiche di actina, abbiamo infettati l'epidermide di topi con delezione specifica per cheratinociti del gene Rac1 ^9. Questo modello ha permesso di studiare le conseguenze delle carenti Rac1 sull'efficienza di HSV-1 negli strati epidermici cheratinociti. Il confronto di epidermide infette del controllo littermates ririvelò alcuna differenza significativa, indicando che l'assenza di Rac1 non ha avuto effetto sulla apertura di infezione nello strato basale dell'epidermide ^7. L'utilizzo di ulteriori modelli murini ci ha permesso di affrontare le quali recettori cellulari mediano ingresso nell'epidermide. Infettare fogli epidermica sia da nectin-1 o topi HVEM-deficienti con HSV-1 ha rivelato che l'ingresso del virus iniziale in tessuto dipende fortemente dalla presenza di nectin-1 ^10. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che HVEM può anche servire come recettore nell'epidermide murini, anche se meno efficiente rispetto nectin-1 ^10.

Per affrontare la distribuzione spaziale delle cellule infettate negli strati epidermici, visualizziamo espressione ICP0 in sezioni di tessuto e epidermiche monti interi (Figura 1). In criosezioni di pelle completa, nessuna cellula-ICP0 esprimono vengono rilevati (Figura 1). Al contrario, criosezioni di fogli epidermiche dimostrano citoplasmaticaEspressione ICP0 nello strato basale a 3 ore già pi (Figura 1). In tempi più recenti, la diffusione virale di soprabasali strati può essere visualizzato. La distribuzione spaziale delle cellule infette nello strato basale può essere facilmente seguita in epidermiche supporti interi (Figura 1). Al momento l'infezione da HSV-1 a 100 PFU / cellula, circa il 50% dei cheratinociti basali dell'epidermide interfollicolari mostrano espressione ICP0 a 1,5 ore pi A questo punto momento cellule più infettate esprimono ICP0 nucleare. La rilocalizzazione della ICP0 nel citoplasma che indica una fase successiva dell'espressione genica precoce è presente in quasi tutte le cellule a 3 ore pi (Figura 1). Queste modalità di visualizzazione cellule infette su ex vivo HSV-1 forniscono un potente test per studiare l'effetto degli inibitori o di componenti cellulari mutate cancellati / su ingresso del virus e la diffusione nel tessuto.