Herpes simplex virus (HSV) kunnen verschillende ziekten bij mensen van mild ongecompliceerde mucocutane laesies tot levensbedreigende infecties. HSV type 1 (HSV-1) is dominant geassocieerd met orofaciale infectie en encefalitis, terwijl HSV type 2 (HSV-2) waarschijnlijk veroorzaakt genitale infecties ^1. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van hoe HSV binnenkomt cellen in cultuur, initieert infectie en produceert virale nageslacht, weten we weinig over de virale invasie route (s) in het weefsel op cellulair niveau ^2. Voor studies van HSV huid of mucosale infecties, muizen, hebben konijnen en cavia's gebruikt als diermodellen. Huidinfectie werd vastgesteld door intradermale injectie of door krassen van de huid in de aanwezigheid van virus, en ziekteontwikkeling werd gecorreleerd met virusproductie. Deze werkwijzen geholpen om verschillende aspecten van de ziekte pathogenese begrijpen, en worden gebruikt om antivirale middelen te evalueren. HSV infectie studeren aan de tissue niveau zijn organotypische menselijke huid modellen toegepast. Als de snelheid van de infectie beperkt is in deze raft culturen, hebben slechts een beperkt aantal studies die een infectie, virale verspreiding en de effecten van antivirale componenten gepubliceerd ^3-6.

Om cellulaire determinanten die een rol spelen tijdens HSV-1 infectie in de intacte epitheel karakteriseren hebben we een protocol voor ex vivo studies infectie van muizen epidermis ^7. Huid werd bereid uit pasgeborenen en uit de staart van volwassen muizen. Omdat HSV-1 niet kunnen infecteren volledige huid monsters, die werden ondergedompeld in virusbevattende medium, we scheidde de epidermis van de dermis met dispase II behandelen. Na drijven van de epidermale bladen op virus-bevattend medium kunnen geïnfecteerde cellen worden gevisualiseerd in de epidermale basale laag op verschillende tijdstippen na infectie (pi) ^7. Om de opening van de infectie in individuele cellen voorafgaand visualiseren om virale replicatie eennd virusproductie, we gekleurd met een antilichaam tegen de geïnfecteerde cel proteïne 0 (ICP0), één van de eerste eiwitten die tijdens HSV-1 infectie. De cellulaire lokalisatie van ICP0 doorloopt verschillende fasen tijdens de vroege infectie. Hoewel ICP0 aanwezig in nucleaire foci in een vroeg stadium van virale genexpressie, herlokalisatie van ICP0 naar het cytoplasma duidt een volgende fase van de infectie ^8.

We gebruikten de ex vivo infectie assay van epidermale bladen van verschillende muismodellen om de mogelijke rol van verschillende cellulaire factoren testen tijdens infectie. Om het effect van Rac1 als een belangrijke regulator van actine dynamiek pakken we besmette epidermis van muizen met een keratinocyt-specifieke deletie van het gen Rac1 ^9. Dit model konden we de gevolgen van deficiënte Rac1 bestuderen van de efficiëntie van HSV-1 infectie bij epidermale keratinocyten lagen. De vergelijking met geïnfecteerde epidermis controle nestgenoten opnieuwgeopenbaard geen significant verschil wat aangeeft dat het ontbreken van Rac1 geen invloed op de inleiding van infectie in de basale laag van de epidermis ⁷ had. Het gebruik van verdere muismodellen konden we pakken die cellulaire receptoren bemiddelen binnenkomst in de opperhuid. Infecteren epidermale bladen van ofwel Nectin-1- of HVEM-deficiënte muizen met HSV-1 onthulde dat de eerste virale binnenkomst in weefsel sterk afhankelijk van de aanwezigheid van Nectin-1 ^10. Bovendien tonen onze resultaten aan dat HVEM ook kan dienen als receptor in muizen epidermis, hoewel minder efficiënt dan Nectin-1 ^10.

Om de ruimtelijke verdeling van de geïnfecteerde cellen in de epidermale lagen te pakken, visualiseren we ICP0 expressie in weefselsecties en epidermale whole mounts (figuur 1). In cryosecties volledige huid, worden geen ICP0 expressie brengende cellen gedetecteerd (Figuur 1). Daarentegen vriescoupes van epidermale bladen tonen cytoplasmatischeICP0 expressie in de basale laag reeds op 3 uur pi (figuur 1). Op latere tijdstippen, virale verspreiding naar suprabasale lagen kunnen worden gevisualiseerd. De ruimtelijke verdeling van de geïnfecteerde cellen in de basale laag kan gemakkelijk worden gevolgd epidermale whole mounts (figuur 1). Na infectie met HSV-1 bij 100 PFU / cel, ongeveer 50% van de basale keratinocyten in de epidermis interfolliculaire tonen ICP0 expressie in 1,5 uur pi Op dit tijdstip meeste geïnfecteerde cellen tot expressie nucleaire ICP0. De herlokalisatie van ICP0 naar het cytoplasma aangeeft een later stadium van vroege genexpressie is aanwezig in bijna alle cellen bij 3 uur pi (figuur 1). Deze modi visualiseren geïnfecteerde cellen na ex vivo HSV-1 infectie een krachtige test om het effect van remmers of gewist / gemuteerde cellulaire componenten op virale binnenkomst en verspreid in het weefsel te bestuderen.