العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1
Summary
The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.
Abstract
للدخول المضيف البشري، نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) يجب التغلب على حاجز الأسطح المخاطية والجلد، أو القرنية. HSV-1 الأهداف الكيراتينية خلال الدخول الأولي، ويضع العدوى الأولية في الظهارة، والتي تبعتها العدوى الكامنة من الخلايا العصبية. بعد تنشيط، يمكن أن الفيروسات تصبح واضحة في مواقع المخاطية الجلدية التي تظهر حويصلات أو قرحات الجلد المخاطية. كيف يغزو HSV-1 الجلد أو الغشاء المخاطي، ويصل غير مفهومة مستقبلاته. للتحقيق في الطريق غزو HSV-1 في أنسجة البشرة على المستوى الخلوي، أنشأنا فيفو السابقين نموذج إصابة البشرة الفئران، وهو ما يمثل الموقع من العدوى الأولية والمتكررة في الجلد. ويشمل الفحص إعداد الجلد الفئران. يتم فصل البشرة من الأدمة عن طريق العلاج dispase الثاني. بعد تعويم ورقة البشرة على المتوسطة التي تحتوي على الفيروس، والنسيج هو ثابت ويمكن تصور العدوى في مختلف الأوقات بعد العدوى عن طريقتلطيخ الخلايا المصابة مع الأجسام المضادة ضد HSV-1 الفوري في وقت مبكر من البروتين ICP0. معربا عن ICP0 الخلايا يمكن ملاحظتها في طبقة الخلايا الكيراتينية القاعدية بالفعل في 1.5 ساعة بعد العدوى. مع أوقات أطول العدوى، تم الكشف عن الخلايا المصابة في طبقات suprabasal، مشيرا إلى أن العدوى لا يقتصر على الخلايا الكيراتينية القاعدية، ولكن الفيروس ينتشر إلى الطبقات الأخرى في الأنسجة. باستخدام أوراق البشرة من نماذج الماوس المختلفة، وبروتوكول العدوى يسمح تحديد إشراك المكونات الخلوية التي تساهم في HSV-1 إلى غزو الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو مناسبة لاختبار مثبطات في الأنسجة التي تتداخل مع خطوات دخول الأولية، وانتشار الخلايا إلى الخلايا وإنتاج الفيروس. هنا، نحن تصف خارج الجسم الحي بروتوكول الإصابة بالتفصيل وتقديم النتائج لدينا باستخدام الفئران nectin-1- أو HVEM ناقصة.
Introduction
فيروس الهربس البسيط (HSV) يمكن أن تسبب مجموعة من الأمراض لدى البشر من آفات جلدية مخاطية غير معقدة خفيفة للعدوى تهدد الحياة. نوع HSV 1 (HSV-1) يرتبط بصورة شائعة مع التهابات فموي وجهي والتهاب الدماغ، في حين HSV نوع 2 (HSV-2) أكثر عرضة يسبب الالتهابات التناسلية 1. في حين أن هناك تقدما كبيرا في فهم كيف يدخل HSV الخلايا في الثقافة، ويبدأ العدوى وينتج ذرية الفيروسية، ونحن نعرف القليل عن مسار الفيروسي الغزو (ق) في الأنسجة على المستوى الخلوي 2. للدراسات HSV الجلد أو التهابات الغشاء المخاطي، والفئران، وقد استخدمت الأرانب والخنازير الغينية كما النماذج الحيوانية. تأسست عدوى الجلد عن طريق الحقن داخل الأدمة أو خدش الجلد في وجود فيروس، وارتبط تطور المرض مع إنتاج فيروس. هذه الأساليب ساعدت على فهم الجوانب المختلفة لإمراض المرض، وتستخدم لتقييم الأدوية المضادة للفيروسات. لدراسة العدوى HSV في TISSUمستوى البريد، وقد طبقت عضوي النمط نماذج الجلد البشري. كما أن معدل الإصابة يقتصر في هذه الثقافات طوف، وقد تم نشر سوى عدد محدود من الدراسات التحقيق العدوى، وانتشار الفيروس وآثار المكونات المضادة للفيروسات 3-6.
من أجل توصيف محددات الخلوية التي تلعب دورا خلال العدوى HSV-1 في ظهارة سليمة، أنشأنا بروتوكول لالسابقين الدراسات المجراة إصابة البشرة الفئران 7. تم إعداد البشرة من الأطفال حديثي الولادة أو من ذيول فئران بالغة. منذ HSV-1 لا يمكن أن تصيب عينات الجلد كاملة، والتي كانت غارقة في المتوسط المحتوية على الفيروس، انفصلنا البشرة من الأدمة من قبل dispase II العلاج. بعد تعويم ورقة البشرة في المتوسط المحتوية على الفيروس والخلايا المصابة يمكن تصور في طبقة البشرة القاعدية في مختلف الأوقات بعد العدوى (بي) 7. لتصور الشروع في العدوى في الخلايا الفردية قبل تكاثر الفيروس لالثاني إنتاج الفيروس، ونحن ملطخة أجسام مضادة ضد بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0)، التي تعد واحدة من البروتينات الأولى أعرب خلال العدوى HSV-1. توطين الخلوية من ICP0 يمر عبر مراحل متميزة خلال العدوى في وقت مبكر. في حين ICP0 موجود في بؤر النووي خلال مرحلة مبكرة من الفيروسية التعبير الجيني، إعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة للإصابة 8.
استخدمنا خارج الجسم الحي الفحص إصابة أوراق البشرة من نماذج مختلفة الماوس لاختبار الدور المحتمل لمختلف العوامل الخلوية خلال العدوى. لمعالجة آثار RAC1 كمنظم رئيسي للديناميات الأكتين، ونحن إصابة البشرة من الفئران مع حذف الخلايا الكيراتينية محددة من الجين RAC1 9. هذا النموذج يسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على نقص RAC1 على كفاءة العدوى HSV-1 في طبقات البشرة الخلايا الكيراتينية. وبالمقارنة مع البشرة المصابة من تتزاحم التحكم إعادةvealed لا يوجد فرق كبير، مشيرا إلى أن غياب RAC1 لم يكن لها تأثير على بدء الإصابة في الطبقة القاعدية من البشرة 7. استخدام المزيد من نماذج الماوس سمح لنا لمعالجة المستقبلات الخلوية التي تتوسط دخول إلى البشرة. اصابة أوراق البشرة من أي nectin-1- أو الفئران التي تعاني من نقص HVEM مع HSV-1 كشفت أن دخول الفيروس الأولي في الأنسجة تعتمد بقوة على وجود nectin-1 10. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن HVEM يمكن أيضا أن تكون بمثابة مستقبلات في البشرة الفئران، على الرغم من أن أقل كفاءة من nectin-1 10.
لمعالجة التوزيع المكاني للخلايا المصابة في طبقات البشرة، ونحن تصور التعبير ICP0 في قطاعات النسيج والبشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). في cryosections من الجلد الكامل، يتم الكشف عن أي خلايا في التعبير عن ICP0 (الشكل 1). في المقابل، cryosections من أوراق البشرة تثبت حشويةالتعبير ICP0 في الطبقة القاعدية بالفعل في 3 ساعات بي (الشكل 1). في أوقات لاحقة، نشر الفيروسية لsuprabasal طبقات يمكن تصور. التوزيع المكاني للخلايا المصابة في الطبقة القاعدية يمكن اتباعها بسهولة في البشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). على العدوى مع HSV-1 في 100 PFU / الخلية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا الكيراتينية القاعدية في البشرة البيني تظهر التعبير ICP0 في 1.5 ساعة بي عند هذه النقطة الوقت معظم الخلايا المصابة تعبر عن ICP0 النووي. وإعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة من أوائل التعبير الجيني موجودة في جميع الخلايا تقريبا في 3 ساعة بي (الشكل 1). هذه الأنماط من تصور الخلايا المصابة على فيفو السابقين HSV-1 العدوى توفر فحص قوية لدراسة تأثير مثبطات أو حذف / المكونات الخلوية متحولة على دخول الفيروس وانتشاره في الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عندما تصاب أوراق البشرة من الجلد للبالغين من C57BL / 6 مع HSV-1 في حوالي 100 PFU / خلية، نلاحظ العدوى في كل ما يقرب من خلايا الطبقة القاعدية في البشرة البيني في حين ترتبط أقل جرعة الفيروس بخلايا أقل المصابة وأبطأ التقدم للعدوى. بشكل عام، تظهر بصيلات الشعر على عدد متغير من الخلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بيتر Staeheli لتوفير الفئران B6.A2G-MX1 وسيمرا أوتشيليك للحصول على المشورة الفنية.
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية من خلال SFB829 وKN536 / 16، وكولن فورتشن برنامج / كلية الطب، جامعة كولونيا.
Materials
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
