Herpes-simplex-Virus (HSV) können eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen von leichten unkompliziert mukokutane Läsionen zu lebensbedrohlichen Infektionen. HSV Typ 1 (HSV-1) wird überwiegend mit orofazialen Infektionen und Enzephalitis assoziiert, während HSV Typ 2 (HSV-2) eher verursacht Genitalinfektionen ^1. Zwar gibt es deutliche Fortschritte im Verständnis, wie HSV tritt in Zellen in Kultur initiiert und produziert Infektion Virusnachkommen, wissen wir wenig über das virale Invasion Weg (e) in das Gewebe auf zellulärer Ebene ^2. Bei Studien von HSV Haut- oder Schleimhautinfektionen, Mäuse, haben Kaninchen und Meerschweinchen als Tiermodelle verwendet. Hautinfektion wurde durch intradermale Injektion oder durch Kratzen der Haut in Gegenwart von Virus etabliert und die Entwicklung der Krankheit wurde mit der Virusproduktion korreliert. Diese Verfahren beigetragen, verschiedene Aspekte der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen, und werden verwendet, um antivirale Medikamente zu bewerten. Um HSV-Infektion am tissu studierene Ebene organotypischen Modelle der menschlichen Haut angewendet wurden. Als die Infektionsrate in diesen Floßkulturen beschränkt ist, nur eine begrenzte Anzahl von Studien, die Infektion, die Virusausbreitung und die Auswirkungen der antiviralen Komponenten veröffentlicht ^3-6.

Um zelluläre Determinanten, die während der HSV-1-Infektion in der intakten Epithels eine Rolle spielen, zu charakterisieren, haben wir ein Protokoll für die Ex-vivo-Infektionsstudien von murinen Epidermis ^7. Haut von Neugeborenen oder von den Schwänzen von erwachsenen Mäusen hergestellt. Da HSV-1 kann er die vollständige Hautproben, die in virushaltige Medium eingetaucht wurden nicht infizieren, die Epidermis von der Dermis getrennt wir durch Behandlung Dispase II. Nach dem Schwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium kann infizierte Zellen in der epidermalen Basalschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (pi) ⁷ visualisiert werden. Um die Einleitung der Infektion in einzelnen Zellen vor der viralen Replikation eine Visualisierungnd Virusproduktion, gebeizt wir mit einem Antikörper gegen die infizierten Zellprotein 0 (ICP0), die eine der ersten Proteine ​​während der HSV-1-Infektion exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisation von ICP0 durchläuft verschiedene Phasen während der frühen Infektion. Während ICP0 ist in Kern Foci vorliegenden während einer frühen Phase der viralen Genexpression, Relokalisierung ICP0 zum Zytoplasma zeigt eine spätere Phase der Infektion ^8.

Wir nutzten die Ex-vivo-Infektionsassay der epidermalen Schichten aus verschiedenen Mausmodellen, um die mögliche Rolle der verschiedenen zellulären Faktoren während der Infektion zu testen. Um die Auswirkungen von Rac1 als Schlüsselregulator der Aktindynamik adressieren, infizierten wir die Epidermis von Mäusen mit einem Keratinozyt-spezifische Deletion des Gens rac1 ^9. Dieses Modell erlaubt es, die Auswirkungen der mangel Rac1 auf den Wirkungsgrad der HSV-1-Infektion in epidermalen Keratinozyten Schichten zu studieren. Der Vergleich zu infizierten Epidermis der Steuerwurfwiedervealed keinen signifikanten Unterschied, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Rac1 hatte keine Wirkung auf die Einleitung der Infektion in der Basalschicht der Epidermis ^7. Die Verwendung weiterer Mausmodellen konnten wir Adresse, die zellulären Rezeptoren vermitteln den Eintritt in die Epidermis. Infizieren epidermalen Schichten entweder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen mit HSV-1 zeigte, dass das anfängliche Eindringen des Virus in Gewebe hängt stark von der Gegenwart von Nectin-1 ^10. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse zeigen, dass HVEM auch als Rezeptor in murine Epidermis weniger effizient zu bedienen, auch wenn als Nectin-1 ^10.

Um die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in den Schichten der Epidermis zu adressieren visualisieren wir ICP0 Expression in Gewebeschnitten und epidermalen Gesamtpräparate (Abbildung 1). In Kryoschnitten von kompletten Haut, werden keine ICP0-exprimierenden Zellen detektiert (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu Kryoschnitte der epidermalen Schichten zeigen zytoplasmatischenICP0 Ausdruck in der basalen Schicht bereits nach 3 Stunden pi (Abbildung 1). Zu späteren Zeitpunkten, virale Verbreitung in Schichten suprabasale visualisiert werden. Die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in der Basalschicht leicht in epidermalen Gesamtpräparate (Figur 1) folgen. Bei der Infektion mit HSV-1 mit 100 PFU / Zelle wurden etwa 50% der basalen Keratinozyten in der Epidermis zeigen interfollikuläre ICP0 Expression bei 1,5 hr pi Zu diesem Zeitpunkt die meisten infizierten Zellen exprimieren Kern ICP0. Die Relokalisierung ICP0 in das Cytoplasma, das einen späteren Stadium der frühen Genexpression ist in nahezu allen Zellen in 3 h pi (Figur 1) vorhanden ist. Diese Modi auf ex vivo HSV-1-Infektion zu visualisieren infizierten Zellen über eine starke Assay zur Bestimmung der Wirkung von Inhibitoren oder gelöschter / mutierten zellulären Komponenten auf die virale Eintritt und die Ausbreitung im Gewebe zu untersuchen.