Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l'isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l'integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l'espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.
Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente 1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l'equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell'organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani 2. Gli esperimenti in modelli animali dimostrano che le cellule IPSC derivati vengono generalmente usate per la terapia cellulare di sostituzione, per esempio, in malattia di Parkinson (PD) 3-5. Tuttavia, alcune limitazioni associate con l'uso di iPSCs rappresentano ostacoli per la piena realizzazione del loro potenziale terapeutico. Prima di tutto, riprogrammazione delle cellule in uno stato pluripotente e successivacontrollo di qualità è generalmente un tempo e processo inefficiente cedevole in ampi e quindi costose procedure di coltura cellulare. In secondo luogo, iPSCs bisogno di essere ri-differenziate nel tipo cellulare desiderato di interesse prima applicazione biomedica e la probabilità di cellule pluripotenti residue nella popolazione differenziata porti un significativo potenziale oncogeno e visualizza quindi un elevato rischio dopo il trapianto di cellule 6. In terzo luogo, il processo di riprogrammazione viene ottenuto inducendo i fattori di riprogrammazione da infezioni lenti- o retrovirale. L'integrazione di questi virus nel genoma dell'ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale e / o riattivazione incontrollata dei transgeni 7,8. I sistemi non integrativi sono stati sviluppati per fornire i fattori di riprogrammazione di cellule bersaglio, che riducono al minimo il rischio di mutagenesi inserzionale e transgene riattivazione. Esempi di questi approcci senza transgene sono la riprogrammazione delle cellule utilizzando non l'integrazioneAdeno o il virus di Sendai 9,10, basati sul DNA vettori 11 o l'applicazione di metodi senza DNA, come la transfezione di mRNA sintetico 12 o trasduzione di proteine ricombinanti 13,14. Un altro metodo promettente per la derivazione del libero-transgene IPSC è l'uso di costrutti riprogrammazione lentivirali loxP modificati e la successiva eliminazione dei transgeni che utilizzano il sistema di ricombinazione Cre-loxP DNA 15,16.
Un approccio più semplice per generare cellule neurali per la terapia di sostituzione cellulare rappresenta conversione diretta dei fibroblasti in neuroni post-mitotico 17-20. Vierbuchen et al. Riferito che la sovraespressione di fattori di trascrizione Ascl1, Brn2 e Myt1l risultati nella generazione di 20% neuroni da fibroblasti murini 17. Nel 2011 è stato dimostrato, che gli stessi tre fattori di trascrizione in combinazione con sovraespressione di NeuroD1 permettono transdifferenziazione di fibroblasti umani in neuRons 19. Umani indotta neuroni potrebbero essere generati anche da sovraespressione di Ascl1 e Ngn2 sotto dual SMAD- e GSK3β- inibizione 20. In particolare, la conversione diretta dei fibroblasti in neuroni genera una popolazione di cellule post-mitotico non proliferativa che non consente ulteriori espansioni e biobanche.
Recentemente, la conversione diretta dei fibroblasti in una popolazione di cellule neurali staminali / progenitrici proliferazione è stato segnalato 21-26. Per motivi di chiarezza, tutti questi tipi cellulari saranno nominati come cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) in questo rapporto. Han et al. Sovraespresso Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 per generare iNPCs. Come i loro omologhi di cellule staminali neurali derivate da cellule o tessuti primaria o pluripotenti questi iNPCs sono tripotential e potrebbero essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti 21. Il nostro gruppo ha un protocollo di conversione leggermente diversa che coinvolge sovraespressione di Sox2, Klf4E c-Myc e indotta Oct4-espressione per 5 giorni soltanto. Con questo approccio si potrebbe generare stabilmente proliferanti iNPCs da murine embrionali e adulte fibroblasti che presentano completo silenziamento della riprogrammazione fattori 22. In contrasto con iPSCs, iNPCs non presentano un potenziale cancerogeno dopo il trapianto 27. Abbiamo usato le cellule convertito con successo in un modello animale di demielinizzazione, ratti privi di mielina, dimostrando che iNPCs sono clinicamente utili 22. Fino ad allora, gli NPC possono essere generati solo da cellule staminali pluripotenti o tessuto neurale primaria 28-32. iNPCs sono cellule stabilmente espandibili che possono essere crioconservati e sono in grado di differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Sono stati compiuti molti sforzi per adattare il protocollo conversione diretta da mouse per cellule umane 23,26,33,34. Nel 2012 è stato pubblicato che la sovraespressione del singolo fattore Sox2 nei fibroblasti è sufficiente a generare murine e umane iNPCs <sup> 33. Gli autori hanno riferito generazione di iNPCs umani da fibroblasti prepuzio fetali e caratterizzati dalla colorazione contro Sox2 e Nestin. Tuttavia, le cellule bersaglio utilizzate per la riprogrammazione rappresentano un particolare tipo di cellule che non sarà disponibile nella pratica clinica e non vi era alcuna caratterizzazione funzionale delle cellule trasformate da trapianto in un modello animale eseguita. Una pubblicazione più recente descrive la generazione dei progenitori neuronali ristrette da fibroblasti fetali umane da sovraespressione di Sox2, c-Myc e sia Brn2 o Brn4 34. Le linee di cellule generate hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento e potrebbero essere differenziate in vari tipi di neuroni terminali. Tuttavia, l'utilizzo di fibroblasti fetali è sfavorevole, poiché queste cellule sono di origine eterogenea e non si può escludere la presenza di residui esempio, cellule staminali della cresta neurale nei preparati. Nel 2014, Zhu et al. Riportarono la conversione diretta di umano adulto e neonatale fibroblasti in cellule progenitrici neurali tripotential di sovraespressione di Sox2 insieme con Oct4 o Oct4 da solo e l'aggiunta di piccole molecole ai media di coltura cellulare. In particolare, in base al loro studi Sox2 solo non era sufficiente per indurre conversione diretta 26. Più recentemente, Lu et al., Ha riferito che la sovraespressione della Yamanaka fattori Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc dal virus Sendai per 24 ore e successiva inattivazione del virus da un aumento di temperatura risultati nella generazione di espandibile neurale tripotential cellule precursori 23. In conclusione, anche se i protocolli di conversione pubblicati per le cellule umane finora hanno in comune la sovraespressione di almeno uno o più dei fattori Yamanaka, spesso in modo tempestivo ristretta, non vi è alcuna chiara indicazione dei fattori molecolari minimi necessari per guidare diretta conversione in iNPCs. La sovraespressione tempestivo limitato di Oct4 genetici, con mezzi, trasfezione con mRNA sintetico, oppure cproteine ell permeanti insieme con l'espressione costitutiva di Sox2, Klf-4, e c-Myc, non ha dato luogo a linee umane stabili INPC ancora. Pertanto, l'applicazione di virus Sendai a overexpress tutti fattori Yamanaka e tempestive limitare la loro attività mediante inattivazione termica del virus 23 unitamente alle condizioni di induzione neurale multimediali ottimizzate 22,31 rappresenta la strategia preferita finora.
Diversi studi dimostrano la funzionalità cellulare di cellule staminali neurali o dei loro omologhi differenziate in diversi modelli di malattie degli animali. Progenitori neurali da cellule staminali umane pluripotenti sono state trapiantate in modelli murini della malattia neuroinfiammatoria sclerosi multipla 35,36. L'applicabilità di cellule progenitrici neurali hESC-derivati in EAE (encefalomielite autoimmune sperimentale) -mice stato mostrato nel 2008 35. Cellule precursori neurali multipotenti sono state iniettate nei ventricoli del cervello di topo, e il risultato del trapiantocato nella riduzione dei segni clinici di EAE. Kim et al. Generato precursori oligodendrogliali di hESC e trapiantato quelli intracerebroventricolare in EAE-topi. Anche se il trapianto non sopravvissero per più di 10 giorni, i topi hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione neurologica e la riduzione delle cellule immunitarie proinfiammatorie nella sostanza bianca 36. Terapia con cellule staminali è stato applicato anche per il targeting preclinico della malattia di Parkinson come PNG potrebbero essere impiegati con successo nei rispettivi modelli animali. Per questo, le cellule progenitrici sono stati derivati da tessuto cerebrale fetale 37 differenziate da cellule staminali pluripotenti 38-40 o cellule staminali mesenchimali 41 sono state usate. Nel 2012 abbiamo dimostrato che iNPCs mouse sono in grado di produrre la proteina proteolipid, la principale componente proteica mielina, dopo il trapianto nel cervello di mielina-deficienti (md) ratti 22. Con questo esperimento prova di principio del applicabil terapeuticalità di iNPCs primo luogo è stato provato e subito confermata da un altro studio 32. Tuttavia, il pieno potenziale di uso terapeutico di iNPCs umani rimane da esplorare.
Qui vi mostriamo un processo affidabile e integrata di (i) derivazione di cellule primarie umane da pazienti adulti tramite biopsia della pelle, (ii) la conversione diretta di fibroblasti umani in uno stato progenitore neuronale e (iii) la capacità di iNPCs essere differenziati in neuronale e lignaggi gliali. L'utilizzo di questo protocollo contribuirà ad accelerare la generazione di cellule umane autologhe per applicazioni terapeutiche.
Qui vi mostriamo l'isolamento e la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali senza transgene espandibili e la loro progenie differenziata come base putativo per la terapia cellulare di sostituzione o l'applicazione in analisi lo screening di stupefacenti. Conversione lineage diretta di cellule somatiche nel NPC è stato ottenuto mediante espressione forzata di trascrizione specifici lineage fattori 26,33,34. Tuttavia, in molti casi fibroblasti fetali sono stati usati per…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare tutti i membri della cellula formativa e medicina rigeneratrice Group dell'Università di Würzburg per utili suggerimenti e Martina Gebhardt, nonché Heike Arthen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), il Ministero dell'Istruzione e della Ricerca tedesco BMBF (01 GN 0813), i bavaresi Research Network pluripotenti indotte cellule staminali "forIPS" e la "Stiftung Sibylle Assmus ". La figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier medica Arte, disponibile da www.servier.com.
Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
cAMP | Sigma | A6885 | |
CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
Dispase | PAN | P10-032100 | |
DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
DMSO | Roth | 4720 | |
DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
FCS | Biochrom AG | 50115 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Gentamicin | Sigma | G1397 | |
GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
hLIF | Peprotech | 300-05 | |
Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
Vitamin C | Sigma | A4544 | |
Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |