Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

En 2006 Yamanaka et ses collègues ont pu montrer pour la première fois la possibilité d'une reprogrammation de cellules somatiques dans un état ​​pluripotent ^1. Cette dédifférenciation a été obtenue par la surexpression de quatre facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc dans des fibroblastes murins. Les dits induits des cellules souches pluripotentes générés (CISP) montrent l'équivalence fonctionnelle de cellules souches embryonnaires (CSE) et peuvent donc être différenciées en tous les types de l'organisme adulte cellulaires. Un an plus tard, à la reprogrammation CSPi pourrait aussi être atteint pour les fibroblastes humains ^2. Des expériences sur des modèles animaux démontrent que les cellules iPSC dérivés peuvent généralement être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, par exemple dans des maladies (le PD) de Parkinson ^5.3. Cependant, plusieurs limites associées à l'utilisation des CSPi représentent barrages routiers pour la pleine réalisation de leur potentiel thérapeutique. De tous, la reprogrammation de cellules d'abord dans un état pluripotent et aprèscontrôle de la qualité est généralement un temps et processus inefficace rendement dans les procédures de culture cellulaire vastes et donc coûteuses. Deuxièmement, iPSCs doivent être re-différencié dans le type cellulaire souhaité d'intérêt avant l'application biomédicale et de la probabilité de cellules pluripotentes résiduels dans la population différenciée recèle un important potentiel tumorigène et affiche ainsi un risque élevé après la transplantation de cellules ^6. En troisième lieu, le processus de reprogrammation est habituellement obtenue en induisant les facteurs de reprogrammation par infection rétrovirale ou lenti-. L'intégration de ces virus dans le génome de l'hôte pourrait conduire à la mutagenèse par insertion et / ou la réactivation incontrôlée des transgènes ^7,8. Les systèmes non-intégration ont été développés pour fournir les facteurs de reprogrammation pour cibler les cellules, ce qui minimise le risque de mutagenèse insertionnelle et transgène réactivation. Des exemples de ces approches sans transgène sont la reprogrammation de cellules en utilisant non-intégrationAdeno virus Sendai ou ^9,10, vecteurs à base d'ADN ¹¹ ou l'application de méthodes exempts d'ADN, comme la transfection de l'ARNm synthétique ¹² ou transduction de protéines recombinantes ^13,14. Un autre procédé prometteur pour la dérivation de iPSC libre transgène est l'utilisation de constructions de reprogrammation loxP lentiviral modifié et suppression ultérieure de transgènes en utilisant le système de recombinaison Cre-loxP ADN ^15,16.

Une approche plus simple pour générer des cellules neurales pour la thérapie de remplacement de la cellule représente la conversion directe des fibroblastes en neurones post-mitotiques ^17-20. Vierbuchen et al. A rapporté que la surexpression de facteurs de transcription ASCL1, Brn2 Myt1l et des résultats dans la production de 20% des neurones à partir de ¹⁷ fibroblastes murins. En 2011, il a été montré que les trois mêmes facteurs de transcription, en combinaison avec la surexpression de NeuroD1 permettent transdifférenciation des fibroblastes humains en neurons ^19. neurones humaines induite pourraient également être générés par la surexpression de Ascl1 et Ngn2 sous double SMAD- et GSK3β- inhibition ^20. Notamment, la conversion directe des fibroblastes en neurones génère, une population de cellules post-mitotique non-prolifération qui ne permet pas d'expansion et de biobanques.

Récemment, la conversion directe des fibroblastes dans une population de cellules souches neurales / progénitrices prolifération a été signalé ^21-26. Par souci de clarté, tous ces types cellulaires seront nommés en tant que cellules progénitrices neurales induites (de iNPCs) dans ce rapport. Han et al. Surexprimé Brn4, Sox2, c-Myc et Klf4 pour générer iNPCs. Comme leurs homologues de cellules souches neurales dérivées de cellules de tissus soit primaire ou pluripotentes ces iNPCs sont tripotential et pourraient être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes ^21. Notre groupe a rapporté un protocole de conversion légèrement différente impliquant la surexpression de Sox2, Klf4Et c-Myc et induite Oct4-expression pour 5 jours seulement. Avec cette approche, nous pourrions générer proliférant de manière stable iNPCs de embryonnaires et adultes fibroblastes murins qui présentent silencieux complet des facteurs de la reprogrammation ^22. Contrairement à iPSCs, iNPCs ne présentent pas de pouvoir tumorigène ²⁷ après la transplantation. Nous avons utilisé des cellules converti avec succès dans un modèle animal de démyélinisation, rats déficients en myéline, ce qui démontre que iNPCs sont cliniquement utiles ^22. Jusque-là, les PNJ ne pourraient être générés à partir de cellules souches pluripotentes ou tissu neural primaire ^28-32. iNPCs sont des cellules de manière stable extensibles qui peuvent être cryoconservés et sont capables de se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. Beaucoup d'efforts ont été faits pour adapter le protocole de conversion directe de la souris à des cellules humaines ^23,26,33,34. En 2012, il a été publié que la surexpression du facteur de Sox2 unique dans des fibroblastes est suffisante pour générer murin et humain iNPCs <sjusqu'à> 33. Les auteurs ont rapporté génération de iNPCs droits de fibroblastes de prépuce fœtales et les caractérisent par coloration contre Sox2 et Nestin. Cependant, les cellules cibles utilisés pour la reprogrammation représentent un type de cellule très particulière qui ne sera pas disponible en pratique clinique et il n'y avait pas la caractérisation fonctionnelle des cellules converties par la transplantation dans un modèle animal effectué. Une publication plus récente décrit la génération des progéniteurs neuronaux restreintes de fibroblastes foetaux humains par la surexpression de Sox2, c-Myc et soit Brn2 ou Brn4 ^34. Les lignées cellulaires générées ont montré une capacité d'auto-renouvellement et peuvent se différencier en différents types de neurones terminaux. Cependant, l'utilisation de fibroblastes foetaux est défavorable, étant donné que ces cellules sont d'origine hétérogène et on ne peut pas exclure la présence de résidus, par exemple, les cellules souches de la crête neurale dans les préparations. En 2014, Zhu et al. Ont rapporté la conversion directe de l'être humain adulte et néonatales fibroblastes en cellules progénitrices neurales tripotential par la surexpression de Sox2 avec Oct4 ou Oct4 seul et l'addition de petites molécules à des milieux de culture cellulaire. Notamment, sur la base de leurs études Sox2 seule était insuffisante pour induire une conversion directe ^26. Plus récemment, Lu et al. A rapporté que la surexpression de la Yamanaka facteurs Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc par virus Sendai pendant 24 heures et l'inactivation ultérieure du virus par l'augmentation des résultats de température dans la génération de neurones expansible tripotential ²³ cellules précurseurs. En conclusion, bien que les protocoles de conversion publiés pour les cellules humaines ont jusqu'ici en commun la surexpression d'au moins un ou plusieurs des facteurs Yamanaka, souvent en temps opportun restreint, il n'y a aucune indication claire des facteurs moléculaires minimales nécessaires à la conduite directe conversion en iNPCs. La surexpression de Oct4 opportun limité par des moyens génétiques, la transfection avec de l'ARNm synthétique, ou cprotéines ell infiltrant avec une expression constitutive de Sox2, Klf-4, et c-Myc n'a pas abouti à des lignées stables INPC humains encore. Ainsi, l'application de virus Sendai à surexpriment tous les facteurs Yamanaka et en temps opportun de limiter leur activité par inactivation par la chaleur des virus ²³ ainsi que les conditions d'induction de médias optimisés ^22,31 neuronal représente la stratégie préférée à ce jour.

Plusieurs études démontrent la fonctionnalité cellulaire de NNC ou leurs homologues différenciées dans les différents modèles de maladies animales. Progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines ont été transplantées dans des modèles murins de la maladie de la sclérose en plaques neuroinflammatoire ^35,36. L'applicabilité de cellules progénitrices neurales CSEh dérivées dans l'EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) -mice a été montré la première fois en 2008 ^35. Cellules précurseurs neurales multipotentes ont été injectés dans les ventricules du cerveau de la souris, et le résultat de la transplantationed dans la réduction des signes cliniques de l'EAE. Kim et al. Généré précurseurs oligodendrogliales de CSEh et transplanté ceux intracérébroventriculairement dans EAE-souris. Bien que les greffes ne survivent pas plus de 10 jours, les souris ont montré une amélioration significative de la fonction et de la réduction des cellules immunitaires pro-inflammatoires dans la substance blanche ³⁶ neurologique. la thérapie de cellules souches a également été appliquée pour le ciblage préclinique de la maladie de Parkinson que les PNJ peuvent être utilisés avec succès dans les modèles animaux respectifs. Pour cela, les cellules progénitrices ont été soit dérivées de tissu cérébral fœtal ³⁷ différenciées à partir de cellules souches pluripotentes ^{38 à 40} ou de cellules souches mésenchymateuses ⁴¹ ont été utilisés. En 2012, nous avons montré que iNPCs de souris sont capables de produire une protéine protéolipidique, la principale composante de protéine de la myéline, après la transplantation dans le cerveau de rats (md) de la myéline déficient ^22. Par cette expérience preuve-de-principe APPLICABIL thérapeutiquelité de iNPCs a d'abord été prouvé et bientôt confirmé par une autre étude ^32. Toutefois, le potentiel d'utilisation thérapeutique de iNPCs humains reste à explorer.

Ici, nous montrons un processus robuste et intégré de (i) la dérivation de cellules primaires humaines de patients adultes par biopsie de la peau, (ii) la conversion directe de fibroblastes humains dans un état progénitrices neurales et (iii) la capacité de iNPCs à se différencier en neurones et lignages gliales. L'utilisation de ce protocole aidera à accélérer la génération de cellules humaines autologues pour des applications thérapeutiques.