Summary

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Published: July 29, 2015
doi:

Summary

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Abstract

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos da pele de adultos e subsequente diferenciação em células somáticas oferece perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos que contornar as barreiras de histocompatibilidade. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação completa em linhagens desejadas continua a ser um obstáculo para a tradução clínica da tecnologia iPSC por causa do potencial instabilidade genômica e neoplásico associado. Recentemente, nós e os outros mostraram que as células somáticas não só pode ser convertido em iPSCs mas também em diferentes tipos de células-tronco somáticas multipotentes usando fatores definidos, evitando assim a progressão através do estado pluripotente. Em particular, a conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) anuncia a possibilidade de uma fonte de células autólogas novo para várias aplicações tais como a substituição de células, modelagem doençae o rastreio de drogas. Aqui, descrevemos o isolamento de fibroblastos primários humanos adultos por biópsia da pele e sua eficiente conversão direta em iNPCs por expressão oportuna restrito de Oct4, Sox2, Klf4, bem como c-Myc. Colónias neuroepiteliais Sox2-positivos aparecem após 17 dias de indução e linhas INPC pode ser estabelecida de forma eficiente pelo isolamento monoclonal e expansão. Ajuste preciso da multiplicidade de infecção viral e suplementação do fator inibidor de leucemia durante a fase de indução representam fatores críticos para alcançar a eficiência de conversão de até 0,2%. Até agora, as linhas INPC específicos do paciente poderia ser expandida para mais do que 12 passagens e uniformemente exibir características morfológicas e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais, tais como a expressão de nestina e Sox2. As linhas INPC podem ser diferenciados em neurônios e astrócitos como avaliado por coloração contra TUJ1 e GFAP, respectivamente. Em conclusão, nós relatamos um protocolo robusto para a derivação e direct conversão de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais de forma estável expansíveis que podem fornecer uma fonte celular para aplicações biomédicas, tais como a substituição da célula neural autólogo e modelagem de doença.

Introduction

Em 2006 Yamanaka e colegas pode mostrar pela primeira vez, a possibilidade de reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente 1. Este desdiferenciação foi conseguida por sobre-expressão de quatro factores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de murino. Os chamados células estaminais pluripotentes induzidas gerados (IPSCs) mostram a equivalência funcional para células estaminais embrionárias (CES) e pode, assim, ser diferenciadas em todos os tipos de células do organismo adulto. Um ano mais tarde, a reprogramação iPSCs também poderia ser conseguido, por fibroblastos humanos 2. Experiências em modelos animais demonstraram que as células iPSC derivados podem em geral ser utilizadas para a terapia de substituição de células, por exemplo, na doença de Parkinson (DP) de 3-5. No entanto, várias limitações associadas com o uso de iPSCs representam obstáculos para a plena realização de seu potencial terapêutico. Em primeiro lugar, a reprogramação das células para um estado pluripotente e subsequentecontrolo de qualidade é geralmente um processo demorado e ineficiente, produzindo, em procedimentos de cultura de células extensos e, portanto, dispendiosas. Em segundo lugar, iPSCs precisa de voltar a ser diferenciadas em células do tipo desejado de interesse antes da aplicação biomédica e a probabilidade de células pluripotentes residuais na população diferenciada abriga um potencial tumorigénico significativa e, assim, exibe um risco elevado após o transplante de células 6. Em terceiro lugar, o processo de reprogramação é normalmente conseguida através da indução de factores de reprogramação por infecção lenti- ou retroviral. A integração destes vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese por inserção e / ou reactivação descontrolada dos transgenes 7,8. Sistemas não-integrativos foram desenvolvidos para entregar os fatores de reprogramação para células alvo, o que minimiza o risco de mutagénese de inserção do transgene e reactivação. Exemplos para essas abordagens livre de transgenes são a reprogramação de células usando não-integraçãoAdeno ou vírus Sendai 9,10, vectores baseados em DNA ou 11 a aplicação de métodos de DNA-free, como a transfecção de ARNm sintético 12 ou transdução de proteínas recombinantes 13,14. Outro método promissor para a derivação de livre-iPSC transgene é a utilização de construções de reprogramação de lentivírus modificadas-loxP e eliminação subsequente de transgenes que utilizam o sistema de recombinação Cre-loxP DNA 15,16.

Uma abordagem mais simples para gerar células neurais para a terapia de substituição de células representa conversão directa de fibroblastos em neurônios pós-mitóticas 17-20. Vierbuchen et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores de transcrição Ascl1, Brn2 Myt1l e resulta na geração de 20% de neurónios de fibroblastos de murino 17. Em 2011 ele foi mostrado para que os mesmos três fatores de transcrição em combinação com superexpressão de NeuroD1 permitir transdiferenciação dos fibroblastos humanos em neurons 19. Neurônios humanos induzida também pode ser gerada por superexpressão de Ascl1 e NGN2 sob dupla SMAD- e GSK3β- inibição 20. Notavelmente, a conversão directa de fibroblastos em neurónios gera, uma população de células pós-mitóticas não proliferativa que não permite uma maior expansão e biobanking.

Recentemente, a conversão directa de fibroblastos para uma população de células neurais tronco / progenitoras proliferam foi relatado 21-26. Por razões de clareza, todos estes tipos de células serão nomeados como células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) neste relatório. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 para gerar iNPCs. Tal como os seus homólogos de células-tronco neurais derivadas de células ou de tecidos primária ou pluripotentes estes iNPCs são tripotential e poderia ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 21. Nosso grupo relatou um protocolo de conversão ligeiramente diferente envolvendo superexpressão de Sox2, Klf4, E c-Myc e induzida por expressão para Oct4 apenas 5 dias. Com esta abordagem que poderia gerar de forma estável proliferação de iNPCs embrionárias e adultas fibroblastos de murino que exibem silencioso completo da reprogramação fatores 22. Em contraste com iPSCs, iNPCs não apresentam um potencial tumorigénico 27 após o transplante. Utilizamos com sucesso células convertido em um modelo animal de desmielinização, ratos deficientes em mielina, demonstrando que são clinicamente úteis iNPCs 22. Até então, NPCs só poderia ser gerada a partir de células-tronco pluripotentes ou tecido neural primário 28-32. iNPCs são estavelmente células expansíveis que podem ser criopreservadas e são capazes de se diferenciar em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Muito esforço tem sido feito para adaptar o protocolo conversão direta de mouse para células humanas 23,26,33,34. Em 2012, foi publicado que a superexpressão do único fator Sox2 em fibroblastos é suficiente para gerar murino e humanos iNPCs <sup> 33. Os autores relataram geração de iNPCs humanos a partir de fibroblastos de prepúcio fetais e caracterizada pela coloração-los contra Sox2 e Nestin. No entanto, as células alvo utilizadas para reprogramação representam um tipo muito particular de células que não estará disponível na prática clínica e não havia nenhuma caracterização funcional de células convertidos por transplante num modelo animal realizada. Uma publicação mais recente descreve a geração de células progenitoras neuronais restritas de fibroblastos fetais humanos por sobre-expressão de Sox2, c-Myc e um ou outro ou Brn2 Brn4 34. As linhas de células geradas mostrou capacidade de auto-renovação e pode ser diferenciadas em vários tipos de neurónios terminais. No entanto, a utilização de fibroblastos fetais é desfavorável, uma vez que estas células são de origem heterogénea e não se pode excluir a presença de, por exemplo residual, as células estaminais da crista neural nas preparações. Em 2014, Zhu et al. Relataram a conversão direta de humano adulto e neofibroblastos natais em células progenitoras neurais tripotential por sobre-expressão de Sox2 juntamente com Oct4 ou Oct4 sozinho e adição de moléculas pequenas para o meio de cultura celular. Nomeadamente, com base na sua estudos Sox2 sozinhos foi insuficiente para induzir a conversão directa 26. Mais recentemente, Lu et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores Oct4- o Yamanaka, Sox2-, Klf4-, c-Myc pelo vírus Sendai, durante 24 horas e subsequente inactivação do vírus por um aumento da temperatura resulta na geração de neural tripotential expansível 23 células precursoras. Em conclusão, apesar de os protocolos publicados para a conversão de células humanas até agora têm em comum a sobre-expressão de pelo menos um ou mais dos factores de Yamanaka, muitas vezes, de uma forma atempada restrito, não há nenhuma indicação clara dos factores moleculares mínimos necessários para dirigir directa conversão em iNPCs. A sobre-expressão atempada restrito de Oct4, quer por meios genéticos, transfecção com ARNm sintético, ou cproteína ell-permeante em conjunto com a expressão constitutiva de Sox2, Klf-4, c-Myc e não resultou em linhas estáveis ​​INPC humanos ainda. Assim, a aplicação do vírus Sendai para sobre-expressar todos os factores Yamanaka e oportuno limitar a sua actividade de inactivação por calor do vírus 23 em conjunto com as condições optimizadas dos meios de indução neural 22,31 representa a estratégia preferida até agora.

Vários estudos demonstram a funcionalidade celular de NSCs ou os seus homólogos diferenciadas em diferentes modelos de doença animal. Progenitores neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas foram transplantadas em modelos do rato da doença neuroinflamatória esclerose múltipla 35,36. A aplicabilidade de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas, em EAE (encefalomielite auto-imune experimental) -mice foi mostrado pela primeira vez em 2008 35. As células precursoras neurais multipotentes foram injetadas nos ventrículos do cérebro do rato, e o resultado do transplanteed na redução dos sinais clínicos da EAE. Kim et al., Gerado a partir de precursores oligodendrogliais hESCs e aqueles transplantado por via intracerebroventricular em ratinhos EAE. Embora transplantes não sobreviveram por mais de 10 dias, os ratos apresentaram melhora significativa da função neurológica e redução de células imunes pró-inflamatórios na substância branca 36. Terapia com células-tronco também tem sido aplicada para pré-clínicos segmentação da doença de Parkinson como NPCs poderia ser empregada com sucesso em seus respectivos modelos animais. Para isso, as células progenitoras ou foram derivados a partir de tecido de cérebro fetal 37 diferenciadas a partir de células estaminais pluripotentes 38-40 ou células estaminais mesenquimais foram 41 utilizados. Em 2012, mostrou que iNPCs rato são capazes de produzir a proteína proteolipídica, a principal componente de proteína de mielina, após a transplantação para o cérebro de ratos (MD) deficiente em mielina 22. Por esse experimento prova de princípio a applicabil terapêuticodade de iNPCs foi primeiramente provado e logo confirmada por outro estudo 32. No entanto, o potencial de utilização terapêutica de humanos iNPCs continua a ser explorado.

Aqui mostramos um processo robusto e integrado de (i) a derivação de células primárias humanas a partir de doentes adultos por biópsia da pele, (ii) a conversão directa de fibroblastos humanos em um estado progenitora neuronal e (iii) a capacidade de iNPCs ser diferenciadas em neuronal e linhagens gliais. O uso deste protocolo vai ajudar a acelerar a geração de células humanas autólogas para aplicações terapêuticas.

Protocol

Os fibroblastos humanos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de uma biópsia da pele após a obtenção do consentimento informado ea depuração ética pelo comitê de ética da Universidade de Würzburg, Alemanha (relatório ético não: 96/11 datada de 10.06.2011). 1. punção para biópsia Desinfectar a pele do paciente. Anestesiar parte pele dos quais biópsia será feita a partir de (preferencialmente uma área menos exposta ao sol) com 0,5 a 1 ml de cloridrato de …

Representative Results

Aqui apresenta-se descrição de um processo integrado que permite a geração de células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que tenham sido obtidos por uma biópsia por punção da pele em menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs paciente-specifc pode ser ainda mais diferenciado em linhagens neuronais e gliais e abrigar um enorme potencial para a terapia de substituição de células e modelagem doença. Infecção dos fibroblastos com Oc…

Discussion

Aqui nós mostramos o isolamento e conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais livre de transgenes expansíveis e sua progênie diferenciada como base putativo para a terapia de substituição de células ou aplicação em análises de despistagem de drogas. Conversão directa linhagem de células somáticas em NPCs foi conseguido através da expressão forçada de transcrição específicos de linhagem factores 26,33,34. No entanto, em muitos casos, fibroblastos fetais foram u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a todos os membros da célula-tronco e medicina regenerativa Grupo da Universidade de Würzburg para sugestões úteis e Martina Gebhardt, bem como Heike Arthen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), o Ministério da Educação e Investigação alemão BMBF (01 GN 0813), os bávaros pesquisa Rede pluripotentes induzidas Stem Cells "forIPS" eo "Stiftung Sibylle Assmus ". A Figura 1 foi produzido usando Servier arte médica, disponível a partir de www.servier.com.

Materials

Astrocyte media ScienCell 1801
B27 LifeTechnologies 17504-044
BDNF Peprotech 450-02
Biopsy Punch pfm medical 48301
cAMP Sigma A6885
CHIR99021 Axon medchem 1386
Collagenase Type2 Worthington Biochemical LS004177
Dispase PAN  P10-032100
DMEM LifeTechnologies 41966-029
DMEM F12 LifeTechnologies 11320-033
DMSO Roth 4720
DPBS LifeTechnologies 14190-094
EGF Life Technologies PHG0313
FCS Biochrom AG 50115
GDNF Peprotech 450-10
Gentamicin Sigma G1397
GFAP-antibody Dako Z0334
GlutaMAX LifeTechnologies 35050-038
hLIF Peprotech 300-05
Insulin Seralab GEM-700-112-P
Ki67-antibody NeoMarkers RM-9106-S
L-Glutamine LifeTechnologies 25030-024
Laminin Sigma L2020
N2 LifeTechnologies 17502-048
Nestin-antibody R&D Systems MAB1259
Neurobasal LifeTechnologies 21103-049
Non-essential amino acids LifeTechnologies 11140-050
NSC freezing media Sigma C6295
Oct4-antibody Santa Cruz sc9081
Pax6-antibody Covance PRB-278P
SB431542 Invivogen inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit  LifeTechnologies A1378001
Sodiumpyruvate Life Technologies 11360-039
Sox1-antibody R&D Systems AF3369
Sox2-antibody R&D Systems MAB2018
T3 Santa Cruz sc-205725
Trypsin/EDTA Life Technologies 15400-054
TUJ1-antibody Covance MMS-435P-250
Vitamin C Sigma A4544
Y27632 Calbiochem CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol LifeTechnologies 21985023

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Cite This Article
Meyer, S., Wörsdörfer, P., Günther, K., Thier, M., Edenhofer, F. Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (101), e52831, doi:10.3791/52831 (2015).

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