Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.
Geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos da pele de adultos e subsequente diferenciação em células somáticas oferece perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos que contornar as barreiras de histocompatibilidade. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação completa em linhagens desejadas continua a ser um obstáculo para a tradução clínica da tecnologia iPSC por causa do potencial instabilidade genômica e neoplásico associado. Recentemente, nós e os outros mostraram que as células somáticas não só pode ser convertido em iPSCs mas também em diferentes tipos de células-tronco somáticas multipotentes usando fatores definidos, evitando assim a progressão através do estado pluripotente. Em particular, a conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) anuncia a possibilidade de uma fonte de células autólogas novo para várias aplicações tais como a substituição de células, modelagem doençae o rastreio de drogas. Aqui, descrevemos o isolamento de fibroblastos primários humanos adultos por biópsia da pele e sua eficiente conversão direta em iNPCs por expressão oportuna restrito de Oct4, Sox2, Klf4, bem como c-Myc. Colónias neuroepiteliais Sox2-positivos aparecem após 17 dias de indução e linhas INPC pode ser estabelecida de forma eficiente pelo isolamento monoclonal e expansão. Ajuste preciso da multiplicidade de infecção viral e suplementação do fator inibidor de leucemia durante a fase de indução representam fatores críticos para alcançar a eficiência de conversão de até 0,2%. Até agora, as linhas INPC específicos do paciente poderia ser expandida para mais do que 12 passagens e uniformemente exibir características morfológicas e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais, tais como a expressão de nestina e Sox2. As linhas INPC podem ser diferenciados em neurônios e astrócitos como avaliado por coloração contra TUJ1 e GFAP, respectivamente. Em conclusão, nós relatamos um protocolo robusto para a derivação e direct conversão de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais de forma estável expansíveis que podem fornecer uma fonte celular para aplicações biomédicas, tais como a substituição da célula neural autólogo e modelagem de doença.
Em 2006 Yamanaka e colegas pode mostrar pela primeira vez, a possibilidade de reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente 1. Este desdiferenciação foi conseguida por sobre-expressão de quatro factores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de murino. Os chamados células estaminais pluripotentes induzidas gerados (IPSCs) mostram a equivalência funcional para células estaminais embrionárias (CES) e pode, assim, ser diferenciadas em todos os tipos de células do organismo adulto. Um ano mais tarde, a reprogramação iPSCs também poderia ser conseguido, por fibroblastos humanos 2. Experiências em modelos animais demonstraram que as células iPSC derivados podem em geral ser utilizadas para a terapia de substituição de células, por exemplo, na doença de Parkinson (DP) de 3-5. No entanto, várias limitações associadas com o uso de iPSCs representam obstáculos para a plena realização de seu potencial terapêutico. Em primeiro lugar, a reprogramação das células para um estado pluripotente e subsequentecontrolo de qualidade é geralmente um processo demorado e ineficiente, produzindo, em procedimentos de cultura de células extensos e, portanto, dispendiosas. Em segundo lugar, iPSCs precisa de voltar a ser diferenciadas em células do tipo desejado de interesse antes da aplicação biomédica e a probabilidade de células pluripotentes residuais na população diferenciada abriga um potencial tumorigénico significativa e, assim, exibe um risco elevado após o transplante de células 6. Em terceiro lugar, o processo de reprogramação é normalmente conseguida através da indução de factores de reprogramação por infecção lenti- ou retroviral. A integração destes vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese por inserção e / ou reactivação descontrolada dos transgenes 7,8. Sistemas não-integrativos foram desenvolvidos para entregar os fatores de reprogramação para células alvo, o que minimiza o risco de mutagénese de inserção do transgene e reactivação. Exemplos para essas abordagens livre de transgenes são a reprogramação de células usando não-integraçãoAdeno ou vírus Sendai 9,10, vectores baseados em DNA ou 11 a aplicação de métodos de DNA-free, como a transfecção de ARNm sintético 12 ou transdução de proteínas recombinantes 13,14. Outro método promissor para a derivação de livre-iPSC transgene é a utilização de construções de reprogramação de lentivírus modificadas-loxP e eliminação subsequente de transgenes que utilizam o sistema de recombinação Cre-loxP DNA 15,16.
Uma abordagem mais simples para gerar células neurais para a terapia de substituição de células representa conversão directa de fibroblastos em neurônios pós-mitóticas 17-20. Vierbuchen et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores de transcrição Ascl1, Brn2 Myt1l e resulta na geração de 20% de neurónios de fibroblastos de murino 17. Em 2011 ele foi mostrado para que os mesmos três fatores de transcrição em combinação com superexpressão de NeuroD1 permitir transdiferenciação dos fibroblastos humanos em neurons 19. Neurônios humanos induzida também pode ser gerada por superexpressão de Ascl1 e NGN2 sob dupla SMAD- e GSK3β- inibição 20. Notavelmente, a conversão directa de fibroblastos em neurónios gera, uma população de células pós-mitóticas não proliferativa que não permite uma maior expansão e biobanking.
Recentemente, a conversão directa de fibroblastos para uma população de células neurais tronco / progenitoras proliferam foi relatado 21-26. Por razões de clareza, todos estes tipos de células serão nomeados como células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) neste relatório. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 para gerar iNPCs. Tal como os seus homólogos de células-tronco neurais derivadas de células ou de tecidos primária ou pluripotentes estes iNPCs são tripotential e poderia ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 21. Nosso grupo relatou um protocolo de conversão ligeiramente diferente envolvendo superexpressão de Sox2, Klf4, E c-Myc e induzida por expressão para Oct4 apenas 5 dias. Com esta abordagem que poderia gerar de forma estável proliferação de iNPCs embrionárias e adultas fibroblastos de murino que exibem silencioso completo da reprogramação fatores 22. Em contraste com iPSCs, iNPCs não apresentam um potencial tumorigénico 27 após o transplante. Utilizamos com sucesso células convertido em um modelo animal de desmielinização, ratos deficientes em mielina, demonstrando que são clinicamente úteis iNPCs 22. Até então, NPCs só poderia ser gerada a partir de células-tronco pluripotentes ou tecido neural primário 28-32. iNPCs são estavelmente células expansíveis que podem ser criopreservadas e são capazes de se diferenciar em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Muito esforço tem sido feito para adaptar o protocolo conversão direta de mouse para células humanas 23,26,33,34. Em 2012, foi publicado que a superexpressão do único fator Sox2 em fibroblastos é suficiente para gerar murino e humanos iNPCs <sup> 33. Os autores relataram geração de iNPCs humanos a partir de fibroblastos de prepúcio fetais e caracterizada pela coloração-los contra Sox2 e Nestin. No entanto, as células alvo utilizadas para reprogramação representam um tipo muito particular de células que não estará disponível na prática clínica e não havia nenhuma caracterização funcional de células convertidos por transplante num modelo animal realizada. Uma publicação mais recente descreve a geração de células progenitoras neuronais restritas de fibroblastos fetais humanos por sobre-expressão de Sox2, c-Myc e um ou outro ou Brn2 Brn4 34. As linhas de células geradas mostrou capacidade de auto-renovação e pode ser diferenciadas em vários tipos de neurónios terminais. No entanto, a utilização de fibroblastos fetais é desfavorável, uma vez que estas células são de origem heterogénea e não se pode excluir a presença de, por exemplo residual, as células estaminais da crista neural nas preparações. Em 2014, Zhu et al. Relataram a conversão direta de humano adulto e neofibroblastos natais em células progenitoras neurais tripotential por sobre-expressão de Sox2 juntamente com Oct4 ou Oct4 sozinho e adição de moléculas pequenas para o meio de cultura celular. Nomeadamente, com base na sua estudos Sox2 sozinhos foi insuficiente para induzir a conversão directa 26. Mais recentemente, Lu et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores Oct4- o Yamanaka, Sox2-, Klf4-, c-Myc pelo vírus Sendai, durante 24 horas e subsequente inactivação do vírus por um aumento da temperatura resulta na geração de neural tripotential expansível 23 células precursoras. Em conclusão, apesar de os protocolos publicados para a conversão de células humanas até agora têm em comum a sobre-expressão de pelo menos um ou mais dos factores de Yamanaka, muitas vezes, de uma forma atempada restrito, não há nenhuma indicação clara dos factores moleculares mínimos necessários para dirigir directa conversão em iNPCs. A sobre-expressão atempada restrito de Oct4, quer por meios genéticos, transfecção com ARNm sintético, ou cproteína ell-permeante em conjunto com a expressão constitutiva de Sox2, Klf-4, c-Myc e não resultou em linhas estáveis INPC humanos ainda. Assim, a aplicação do vírus Sendai para sobre-expressar todos os factores Yamanaka e oportuno limitar a sua actividade de inactivação por calor do vírus 23 em conjunto com as condições optimizadas dos meios de indução neural 22,31 representa a estratégia preferida até agora.
Vários estudos demonstram a funcionalidade celular de NSCs ou os seus homólogos diferenciadas em diferentes modelos de doença animal. Progenitores neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas foram transplantadas em modelos do rato da doença neuroinflamatória esclerose múltipla 35,36. A aplicabilidade de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas, em EAE (encefalomielite auto-imune experimental) -mice foi mostrado pela primeira vez em 2008 35. As células precursoras neurais multipotentes foram injetadas nos ventrículos do cérebro do rato, e o resultado do transplanteed na redução dos sinais clínicos da EAE. Kim et al., Gerado a partir de precursores oligodendrogliais hESCs e aqueles transplantado por via intracerebroventricular em ratinhos EAE. Embora transplantes não sobreviveram por mais de 10 dias, os ratos apresentaram melhora significativa da função neurológica e redução de células imunes pró-inflamatórios na substância branca 36. Terapia com células-tronco também tem sido aplicada para pré-clínicos segmentação da doença de Parkinson como NPCs poderia ser empregada com sucesso em seus respectivos modelos animais. Para isso, as células progenitoras ou foram derivados a partir de tecido de cérebro fetal 37 diferenciadas a partir de células estaminais pluripotentes 38-40 ou células estaminais mesenquimais foram 41 utilizados. Em 2012, mostrou que iNPCs rato são capazes de produzir a proteína proteolipídica, a principal componente de proteína de mielina, após a transplantação para o cérebro de ratos (MD) deficiente em mielina 22. Por esse experimento prova de princípio a applicabil terapêuticodade de iNPCs foi primeiramente provado e logo confirmada por outro estudo 32. No entanto, o potencial de utilização terapêutica de humanos iNPCs continua a ser explorado.
Aqui mostramos um processo robusto e integrado de (i) a derivação de células primárias humanas a partir de doentes adultos por biópsia da pele, (ii) a conversão directa de fibroblastos humanos em um estado progenitora neuronal e (iii) a capacidade de iNPCs ser diferenciadas em neuronal e linhagens gliais. O uso deste protocolo vai ajudar a acelerar a geração de células humanas autólogas para aplicações terapêuticas.
Aqui nós mostramos o isolamento e conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais livre de transgenes expansíveis e sua progênie diferenciada como base putativo para a terapia de substituição de células ou aplicação em análises de despistagem de drogas. Conversão directa linhagem de células somáticas em NPCs foi conseguido através da expressão forçada de transcrição específicos de linhagem factores 26,33,34. No entanto, em muitos casos, fibroblastos fetais foram u…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a todos os membros da célula-tronco e medicina regenerativa Grupo da Universidade de Würzburg para sugestões úteis e Martina Gebhardt, bem como Heike Arthen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), o Ministério da Educação e Investigação alemão BMBF (01 GN 0813), os bávaros pesquisa Rede pluripotentes induzidas Stem Cells "forIPS" eo "Stiftung Sibylle Assmus ". A Figura 1 foi produzido usando Servier arte médica, disponível a partir de www.servier.com.
Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
cAMP | Sigma | A6885 | |
CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
Dispase | PAN | P10-032100 | |
DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
DMSO | Roth | 4720 | |
DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
FCS | Biochrom AG | 50115 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Gentamicin | Sigma | G1397 | |
GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
hLIF | Peprotech | 300-05 | |
Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
Vitamin C | Sigma | A4544 | |
Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |