الاشتقاق من الكبار الخلايا الليفية الإنسان والتحويل المباشر إلى داخل الخلايا العصبية للتوسيع السلف

في عام 2006 ياماناكا وزملاؤه يمكن أن تظهر لأول مرة إمكانية إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى دولة المحفزة ^1. وقد تحقق هذا فقد التمايز التي كتبها overexpression من أربعة عوامل النسخ Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على الخلايا الليفية الفئران. ما يسمى الخلايا الجذعية المحفزة ولدت (iPSCs) تظهر التكافؤ الوظيفي للخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، ويمكن بالتالي أن تكون متباينة في جميع أنواع الخلايا الكائن الحي الكبار. سنة واحدة برمجة وقت لاحق لiPSCs ويمكن أيضا أن يتحقق عن الخلايا الليفية الإنسان ^2. وتبين التجارب في النماذج الحيوانية أن الخلايا التوجيهية المستمدة عموما يمكن أن تستخدم لعلاج الخلايا الاستبدال، على سبيل المثال، في مرض باركنسون (PD) ^3-5. ومع ذلك، العديد من القيود المرتبطة باستخدام iPSCs تمثل حواجز الطرق لتحقيق كامل إمكاناتهم العلاجية. أولا وقبل كل شيء، إعادة برمجة الخلايا في حالة المحفزة واللاحقةمراقبة الجودة عموما هو مضيعة للوقت وعملية غير فعالة العائد في إجراءات واسعة، وبالتالي تكلفة زراعة الخلايا. ثانيا، تحتاج iPSCs إلى إعادة متباينة، إلى نوع من الخلايا المطلوبة من الفائدة قبل تطبيق الطب الحيوي، واحتمال الخلايا المحفزة المتبقية في السكان متباينة تؤوي إمكانية مكون للأورام كبيرة، وبالتالي تعرض لمخاطر عالية بعد زرع الخلايا ^6. الثالث، وعادة ما حققت عملية إعادة برمجة عن طريق حفز عوامل إعادة برمجة عن طريق العدوى lenti- أو فيروسات. دمج هذه الفيروسات في جينوم المضيف قد يؤدي إلى الطفرات إقحامي و / أو تنشيط غير المنضبط من الجينات المحورة ^7،8. وقد وضعت الأنظمة غير متكاملة لتوفير عوامل إعادة برمجة لاستهداف الخلايا، التي تقلل من مخاطر الطفرات إقحامي والتحوير تنشيط. أمثلة لهذه النهج خالية من التحوير هي إعادة برمجة الخلايا باستخدام غير دمج-الغدة أو سينداي فيروس ^9،10، ناقلات القائم على DNA ¹¹ أو تطبيق طرق خالية من الحمض النووي، مثل ترنسفكأيشن مرنا الاصطناعية ¹² أو تنبيغ من البروتينات المؤتلف ^13،14. طريقة أخرى واعدة لاشتقاق خالية من التحوير التوجيهية هو استخدام بنيات برمجة lentiviral المعدلة loxP والحذف لاحق من الجينات المحورة باستخدام نظام إعادة التركيب جنة المساواة العرقية، loxP DNA ^15،16.

A نهج أكثر وضوحا لتوليد الخلايا العصبية للعلاج استبدال الخلية يمثل التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا العصبية بعد الإنقسامية ^17-20. Vierbuchen وآخرون. وذكرت أن overexpression من النسخ عوامل Ascl1، Brn2 وMyt1l النتائج في توليد 20٪ من الخلايا العصبية الليفية الفئران ^17. في عام 2011 تم إظهار ذلك، وهذا نفس ثلاثة عوامل النسخ في تركيبة مع overexpression من NeuroD1 تمكن transdifferentiation من الخلايا الليفية الإنسان في الامتحانات الوطنيةعصبونات ^19. ويمكن أيضا أن تتولد الخلايا العصبية البشرية الناجمة عن overexpression من Ascl1 وNgn2 تحت SMAD- المزدوج وGSK3β- تثبيط ^20. والجدير بالذكر أن التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا عصبية يولد غير التكاثري، سكان الخلية بعد الإنقسامية التي لا تسمح مزيد من التوسع والبنوك الحيوية.

مؤخرا، تم الإبلاغ عن التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى السكان الخلية العصبية الجذعية / السلف المتكاثرة ^21-26. من أجل الوضوح، وسيتم تسمية كل هذه الأنواع من الخلايا إلى خلايا العصبية التي يسببها السلف (iNPCs) في هذا التقرير. هان وآخرون. overexpressed Brn4، Sox2، ج. Myc على وKlf4 لتوليد iNPCs. مثل نظرائهم الخلايا الجذعية العصبية المستمدة من الخلايا إما الأنسجة الابتدائية أو المحفزة هذه iNPCs هي tripotential ويمكن أن تكون متباينة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes ^21. ذكرت مجموعتنا بروتوكول تحويل مختلف قليلا تنطوي على overexpression من Sox2، Klf4وج. Myc على والناجم عن Oct4-التعبير لمدة 5 أيام فقط. مع هذا النهج الذي يمكن أن تولد المتكاثرة مستقر iNPCs من الفئران الجنينية والخلايا الليفية الكبار الذي يحمل إسكات كاملة من عوامل إعادة برمجة ^22. وعلى النقيض من iPSCs، لا iNPCs لا يحمل إمكانات مكون للأورام بعد زرع ^27. استخدمنا تحويل خلايا بنجاح في نموذج حيواني من إزالة الميالين، الفئران التي تعاني من نقص المايلين، مما يدل على أن iNPCs هي سريريا مفيدة ^22. حتى ذلك الحين، الشخصيات يمكن أن تتولد فقط من الخلايا الجذعية المحفزة أو الأنسجة العصبية الأولية ^28-32. iNPCs هي خلايا قابلة للتوسيع ثابت التي يمكن cryopreserved وتكون قادرة على التمايز إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes. أحرز بذل الكثير من الجهد للتكيف بروتوكول التحويل المباشر من الفأر إلى الخلايا البشرية ^{23،26،33،34.} في عام 2012 نشرت أن overexpression من عامل Sox2 واحد في الخلايا الليفية غير كافية لتوليد الفئران وiNPCs الإنسان <sتصل> 33. ذكرت والكتاب جيل من iNPCs الإنسان من الخلايا الليفية القلفة الجنين وتتميز لهم من قبل تلطيخ ضد Sox2 وNestin. ومع ذلك، فإن الخلايا المستهدفة تستخدم لإعادة برمجة تمثل نوع من الخلايا خاص جدا التي لن تكون متاحة في الممارسة السريرية وليس هناك توصيف وظيفي للخلايا تحويلها عن طريق زرع في نموذج حيواني تنفيذها. ويصف نشر أحدث جيل من الأسلاف يقتصر العصبية من الخلايا الليفية الجنين البشري من قبل overexpression من Sox2، ج. Myc على وإما Brn2 أو Brn4 ^34. أظهرت خطوط الخلايا المولدة قدرة التجديد الذاتي، ويمكن أن تكون متباينة إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية الطرفية. ومع ذلك، فإن استخدام الخلايا الليفية الجنين غير موات، وهذه الخلايا هي من أصل غير متجانسة واحدة لا يمكن استبعاد وجود مثل المتبقية، والخلايا الجذعية قمة العصبية في التحضيرات. في عام 2014، وقال تشو وآخرون. وذكرت التحويل المباشر من الكبار البشري والجددالليفية الولادة في الخلايا العصبية السلف tripotential التي كتبها overexpression من Sox2 جنبا إلى جنب مع Oct4 أو Oct4 وحده، وبالإضافة إلى ذلك من الجزيئات الصغيرة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية. والجدير بالذكر، بناء على دراساتهم Sox2 وحده لم يكن كافيا للحث على التحويل المباشر ^26. وفي الآونة الأخيرة، لو وآخرون. وذكرت أن overexpression من أن ياماناكا عوامل Oct4-، Sox2-، Klf4-، ج. Myc على فيروس سينداي لمدة 24 ساعة وتعطيل لاحق من الفيروس عن طريق زيادة النتائج درجة الحرارة في توليد العصبية tripotential قابلة للتوسيع خلايا السلائف ^23. في الختام، على الرغم من أن بروتوكولات التحويل نشرت للخلايا البشرية لديها حتى الآن في المشترك وoverexpression من واحد على الأقل أو أكثر من العوامل ياماناكا، في كثير من الأحيان بطريقة مقيدة في الوقت المناسب، لا يوجد مؤشر واضح على العوامل الجزيئية الحد الأدنى اللازم لدفع مباشرة تحويل إلى iNPCs. وoverexpression يقتصر في الوقت المناسب من Oct4 إما عن طريق وسائل الوراثية، ترنسفكأيشن مع مرنا الاصطناعية، أو جلم الذراع-نفيذ البروتين جنبا إلى جنب مع التعبير التأسيسي للSox2، KLF-4، ج. Myc على لم تسفر عن خطوط iNPC الإنسان مستقرة حتى الان. وهكذا، فإن تطبيق فيروس سينداي الى بإفراط عن جميع العوامل ياماناكا وتقييد النشاط في الوقت المناسب من خلال تثبيط الحرارة من الفيروس ²³ جنبا إلى جنب مع تحسين ظروف تحريض وسائل الإعلام العصبي ^22،31 يمثل الاستراتيجية المفضلة حتى الآن.

تظهر العديد من الدراسات وظيفة الخلوية من NSCs أو نظرائهم متباينة في مختلف النماذج الأمراض الحيوانية. تم زرعها الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في نماذج الماوس من اضطراب neuroinflammatory التصلب المتعدد ^35،36. انطباق الخلايا الاصلية العصبية المشتقة HESC في EAE (التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي) وقد أظهرت -mice لأول مرة في عام 2008 ^35. تم حقن الخلايا العصبية السلائف متعددة القدرات في بطينات الدماغ الماوس، ونتيجة زرعإد في الحد من علامات سريرية للEAE. كيم وآخرون. ولدت السلائف oligodendroglial من hESCs وزرع تلك intracerebroventricularly إلى EAE الفئران. على الرغم من أن زرع لم البقاء على قيد الحياة لأكثر من 10 يوما، وأظهرت الفئران تحسنا كبيرا في وظيفة الجهاز العصبي والحد من الخلايا المناعية proinflammatory في المادة البيضاء ^36. كما تم تطبيق العلاج بالخلايا الجذعية لpreclinically استهداف مرض باركنسون كما الشخصيات يمكن أن تستخدم بنجاح في النماذج الحيوانية منها. لهذا، كانت الخلايا الاصلية المستمدة إما من أنسجة دماغ الجنين ³⁷ متباينة من الخلايا الجذعية المحفزة ^38-40 أو الخلايا الجذعية الوسيطة استخدمت ^41. في عام 2012 أظهرنا أن iNPCs الماوس هي قادرة على انتاج بروتين شحم بروتيني، وعنصرا رئيسيا البروتين المايلين، بعد زرع في أدمغة-المايلين ناقصة (MD) الفئران ^22. من خلال تلك التجربة إثبات صحة المبدأ applicabil العلاجيةوقد ثبت إيتي من iNPCs أولا، وأكدت قريبا دراسة أخرى ^32. ومع ذلك، لا تزال هناك امكانات الاستخدام العلاجي للiNPCs الإنسان من يكتشفها.

نحن هنا تظهر عملية قوية ومتكاملة من (ط) اشتقاق الخلايا الأولية الإنسان من المرضى البالغين عن طريق خزعة الجلد، (ب) التحويل المباشر من الخلايا الليفية الإنسان في دولة السلف العصبية و (ج) قدرة iNPCs لتكون متباينة في الخلايا العصبية والأنساب الدبقية. واستخدام هذا البروتوكول يساعد على تسريع جيل من الخلايا البشرية ذاتي للتطبيقات العلاجية.