Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Exposição a substâncias químicas (incluindo alquilantes agentes químicos de guerra, como enxofre e nitrogênio mostardas) causar uma infinidade de sintomas clínicos, incluindo ferida desordem de cura. O processo fisiológico de cicatrização de feridas é altamente complexa. A formação de tecido de granulação é um passo fundamental neste processo, resultando em um fechamento da ferida preliminar e fornecendo uma rede de novos vasos sanguíneos capilares – quer através vasculogenesis (romance de formação) ou a angiogénese (brotação de navios existentes). Ambos vasculo- angiogénese e requerem funcional, migração dirigida de células endoteliais. Assim, a investigação de células endoteliais (CEE) migração precoce é importante para entender a fisiopatologia da química induzida ferida distúrbios de cicatrização e identificar potencialmente novas estratégias para intervenção terapêutica.
Foram avaliados a cicatrização de feridas prejudicada após alquilação exposição agente e testados compostos candidatos potenciais para trratamento. Foi utilizado um conjunto de técnicas delineadas neste protocolo. A câmara de Boyden modificada para investigar quantitativamente quimiocinese da CEE é descrito. Além disso, a utilização do ensaio de cicatrização da ferida, em combinação com a análise de faixas para avaliar qualitativamente migração é ilustrado. Finalmente, que demonstram a utilização do TMRM corante fluorescente para a investigação do potencial de membrana mitocondrial para identificar os mecanismos subjacentes à migração celular perturbado. O protocolo a seguir descreve técnicas básicas que foram adaptadas para a investigação da CEE.
Introduction
A migração celular é importante em muitos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento, várias doenças, e a cicatrização de feridas após a lesão da pele.
Após lesão da pele, inflamação remove as unidades de tecido de granulação e danificados ou necróticas fechamento da ferida preliminar e permite a formação de uma rede de novos capilares através vasculogenesis (romance de formação) ou angiogênese (surgimento de vesículas existentes) 1-3. Ambos vasculo- angiogénese e exige a migração de células endoteliais. A rede de crescimento de vasos sanguíneos é essencial para o transporte de oxigénio e nutrientes para os queratinócitos proliferam que em última análise se submetem a queratinização, formar um novo epitélio e fornecer o fechamento da ferida.
Prejudicada migração de células endoteliais é uma causa subjacente da ferida desordem 4,5 cura. Assim, os métodos para avaliar a migração de células endoteliais iniciais são necessárias para explorar a pathophysiolgia de distúrbios da migração celular e para identificar novas estratégias para a intervenção terapêutica.
Exposição cutânea aos agentes alquilantes (por exemplo, enxofre e mostardas de azoto) provoca transtorno 6 ferida cura. Esses compostos foram utilizados como agentes de guerra química em vários conflitos no século 20 e permanecem motivo para grande preocupação devido à estoques existentes em regiões politicamente instáveis e síntese relativamente simples. Embora mostarda de enxofre foi sintetizado pela primeira vez em 1822, a patologia molecular e clínica de exposição SM não é compreendido em pormenor e um antídoto para a exposição SM foi identificada.
Vários estudos têm sido realizados para compreender e modelar a cicatrização de feridas prejudicada após a exposição SM e para testar compostos potencialmente candidatos capazes de reservar esse efeito. Schmidt et ai (2009). Testaram o efeito de clorambucil, alquilando um composto com propriedades semelhantes a SM em mouSE modelos de corpos embrióides e encontrada uma dramática redução, por vezes mais de 99% na formação dos vasos 7. Este efeito adverso foi mais pronunciado, numa fase de desenvolvimento que, sob condições fisiológicas, é dominada pela proliferação e migração de células precursoras endoteliais vasculares. Assim, estas células foram identificadas como sendo particularmente sensível a agentes de alquilação. Steinritz et ai (2010). Testados sequestrantes de espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente, N-acetilcisteína (NAC) e ácido alfa-linolénico (ALA) para a sua capacidade para reduzir a toxicidade SM em modelos de ratinho embrióides corpo e, em particular, a 8 restaurar a formação de vasos. Foram observados efeitos de protecção temporárias, indicando que a formação de ROS excessiva era susceptível de contribuir para os efeitos adversos da SM na cicatrização de feridas. Estes efeitos não eram permanentes e os dois compostos candidatos pode não ser capaz de restabelecer a formação de vasos e a cicatrização de feridas, a longo prazo 8. However, esses experimentos foram realizados em um complexo modelo 3D, que permitiu que a investigação de migração celular. Assim, subsequentemente testado NAC e ALA para os efeitos benéficos sobre a migração de células de CEE que têm um papel chave no processo de formação de vasos 9.
Além disso, há evidências de que a polaridade da célula é necessária para a migração celular. Disfunção mitocondrial conduzindo a formação de ROS foi mostrado para danificar polaridade celular e pode, consequentemente, afectar adversamente a migração celular. Assim, imagens de células vivas em relação à função mitocondrial foi realizada e os efeitos de ROS sequestrantes foram examinados. O protocolo que se segue descreve os requisitos gerais de cultivo da CEE, o ensaio de câmara de Boyden, o ensaio de cicatrização de feridas, incluindo a análise de células e seguimento da utilização de TMRM para a avaliação da função mitocondrial em detalhe. Aspectos importantes de protocolos experimentais para o cultivo CEE ea migração são realçados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exposição dérmica a substâncias químicas tóxicas, muitas vezes resulta em desordem cicatrização de feridas graves. Os mecanismos subjacentes são em grande parte desconhecido. A cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em diferentes fases (hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação). A migração celular está envolvida em cada fase, no entanto, é de extrema importância para a formação do tecido de granulação. Aqui, novos vasos sanguíneos são formados por angio- ou vas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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