Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Die Exposition gegenüber chemischen Stoffen (einschließlich alkylierende chemische Kampfstoffe wie Schwefel und Stickstoffsenf) führen eine Fülle von klinischen Symptomen wie Wundheilungsstörung. Der physiologische Prozess der Wundheilung ist sehr komplex. Die Bildung von Granulationsgewebe ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, was zu einer vorläufigen Wundverschluss und die Bereitstellung eines Netzes von neuen kapillaren Blutgefäßen – entweder durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (sprießen bestehender Schiffe). Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern funktionale, gerichtete Wanderung von Endothelzellen. Somit ist Untersuchung von frühen Endothelzellen (EWG) Migration wichtig, die Pathophysiologie der chemischen induzierten Wundheilungsstörungen zu verstehen und möglicherweise zu identifizieren neue Strategien für die therapeutische Intervention.
Wir beurteilen Wundheilungsstörungen nach Alkylierungsmittel Belichtung und getestet potenziellen Kandidatenverbindungen für treatment. Wir haben eine Reihe von Techniken, die in diesem Protokoll beschrieben. A modifizierten Boyden-Kammer, um quantitativ zu untersuchen Chemokinese der EWG beschrieben. Darüber hinaus wird die Verwendung der Wundheilungs Assay in Verbindung mit Gleis Analyse qualitativ beurteilen Migration dargestellt. Schließlich zeigen wir die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs TMRM zur Erforschung des mitochondrialen Membranpotentials zu Grunde liegenden Mechanismen der gestörten Zellmigration zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt grundlegende Techniken, die für die Untersuchung der EWG adaptiert wurden.
Introduction
Zellmigration ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung, verschiedene Krankheiten, und die Wundheilung nach Verletzungen der Haut wichtig.
Folgende Hautverletzung, Entzündung beseitigt beschädigte oder nekrotische Gewebe und Granulierung Antriebe vorläufigen Wundverschluß und ermöglicht die Bildung eines Netzwerks von Kapillaren durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (Sprießen von vorhandenen Bläschen) 1-3. Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern Migration von Endothelzellen. Die wachsende Netzwerk von Blutgefäßen ist wichtig, um Sauerstoff und Nährstoffe zu proliferierenden Keratinozyten, die letztlich Verhornung unterziehen zu transportieren, bilden eine neue Epithel und bieten Wundverschluss.
Beeinträchtigt Migration von Endothelzellen ist eine zugrunde liegende Ursache der Wundheilungsstörung 4,5. Somit Methoden zur Messung der Migration der frühen Endothelzellen sind erforderlich, um die pathophysiol erforschenlogie der Zellmigration Störungen und neue Strategien für die therapeutische Intervention zu identifizieren.
Hautexposition Alkylierungsmittel (beispielsweise Schwefel und Stickstoffsenfgas) verursacht Wundheilungsstörung 6. Solche Verbindungen wurden als chemische Kampfstoffe in mehrere Konflikte im 20. Jahrhundert Grund für große Besorgnis wegen der bestehenden Lagerbestände in politisch instabilen Regionen und die relativ einfache Synthese verwendet werden und zu bleiben. Obwohl Senfgas wurde zum ersten Mal im Jahre 1822 synthetisiert wird die molekularen und klinischen Pathologie der SM Exposition nicht im Detail verstanden und kein Gegenmittel für SM Exposition festgestellt wurde.
Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu verstehen und zu einer Beeinträchtigung der Wundheilung nach SM Expositionsmodell und für potenzielle Kandidatenverbindungen, die die Reservierung diese Wirkung zu testen. Schmidt et al. (2009) untersucht die Wirkung von Chlorambucil, einem alkylierenden Verbindung mit ähnlich SM in mou Eigenschaftense Embryoidkörper Modelle und fand eine dramatische, manchmal mehr als 99% ige Reduktion der Gefäßbildung 7. Dieser nachteilige Effekt war besonders im Stadium der Entwicklung, die unter physiologischen Bedingungen durch die Proliferation und Migration der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen dominiert ausgeprägt. Somit wurden diese Zellen identifiziert besonders empfindlich Alkylierungsmittel sein. Steinritz et al. (2010) getestet Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere N-Acetylcystein (NAC) und Alpha-Linolensäure (ALA) auf ihre Fähigkeit zur SM-Toxizität in der Maus Embryoidkörper Modelle und insbesondere zu verringern, Wiederherstellung Gefäßbildung 8. Temporäre Schutzwirkungen wurden nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die übermäßige Bildung von ROS wahrscheinlich war, um die negativen Auswirkungen der SM auf die Wundheilung bei. Diese Effekte waren nicht dauerhaft und die zwei Kandidatenverbindungen nicht wiederherstellen kann Gefäßbildung und Wundheilung langfristig 8 sein. However wurden diese Experimente in einem komplexen 3D-Modell, das ermöglicht Untersuchung der Zellmigration haben durchgeführt. So haben wir anschließend getestet NAC und ALA für eine wohltuende Wirkung auf die Zellmigration der EWG, die eine Schlüsselrolle im Prozess der Gefäßbildung 9 haben.
Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass die Zellpolarität ist für Zellmigration erforderlich. Mitochondriale Dysfunktion, die zu ROS-Bildung wurde gezeigt, dass Zellpolarität beeinträchtigen und somit nachteilig auf die Zellmigration. Daher wurde lebenden Zellen im Hinblick auf die mitochondriale Funktion durchgeführt, und die Wirkungen von ROS-Fänger wurden untersucht. Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeinen Anforderungen für den Anbau von EWG, der Boyden-Kammer-Assay, der Wundheilungsassay einschließlich Zell Tracking-Analyse und den Einsatz von TMRM zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im Detail. Wichtige Aspekte der Versuchsprotokolle für EWG Anbau und Migration werden hervorgehoben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dermale Exposition gegenüber giftigen Chemikalien führt oft zu schweren Wundheilungsstörung. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen (Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung) besteht. Zellmigration in jeder Phase, wie auch immer, ist es von größter Bedeutung für die Bildung von Granulationsgewebe. Hier werden neue Blutgefäße entweder durch Angio- oder Vaskulogenese gebildet.
Be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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