הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
חשיפה לחומרים כימיים (כוללים חומרי לחימה כימית אלקילציה כמו חרדל גופרית וחנקן) לגרום לשפע של תסמינים קליניים כוללים הפרעת ריפוי פצע. התהליך הפיזיולוגי של ריפוי פצע הוא מורכב ביותר. ההיווצרות של רקמת פרור היא צעד מפתח בתהליך זה וכתוצאה מכך סגירת פצעים ראשונית ומתן רשת של כלי דם נימים חדשים – בין אם באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של כלי קיימים). שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה פונקציונלית, בבימויו של תאי האנדותל. כך, החקירה של הגירה מוקדם תא האנדותל (EEC) חשובה להבין הפתופיזיולוגיה של פצע כימי הנגרם על ריפוי הפרעות ופוטנציאל לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית.
חוקרים הערכנו ריפוי פצע לקוי לאחר אלקילציה חשיפת סוכן ונבדקו תרכובות מועמד פוטנציאליות לTReatment. אנחנו השתמשנו בסט של טכניקות שתוארו בפרוטוקול זה. קאמרי בוידן שונה כדי לחקור כמותית chemokinesis של השוק האירופי המשותף מתואר. יתר על כן, השימוש בריפוי הפצע assay בשילוב עם ניתוח מסלול להעריך הגירה איכותית בא לידי ביטוי. לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש בTMRM הצבע פלואורסצנטי לחקירת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לזהות מנגנונים של נדידת תאים מופרעת. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות בסיסיות שהותאמו לחקירת EEC.
Introduction
נדידת תאים היא חשובה בתהליכים פיסיולוגיים רבים וpathophysiological כוללים פיתוח, מחלות שונות, וריפוי פצעים לאחר פציעת עור.
בעקבות פציעת עור, דלקת מסירה כונני רקמה ופרור פגומים או נמקי סגירת פצע ראשונית ומאפשרת היווצרות של רשת של נימי דם חדשים באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של שלפוחית הקיימת) 1-3. שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה של תאי האנדותל. הרשת הולכת והגדלה של כלי דם חיונית להובלת חמצן וחומרים מזינים למתרבה קרטינוציטים שסופו של דבר לעבור קרטיניזציה, יוצר האפיתל חדש ולספק סגירת פצע.
הגירה לקויה של תאי האנדותל היא סיבה בסיסית של ריפוי פצע הפרעת 4,5. הגירה כך, שיטות להערכה של תאי האנדותל מוקדמים נדרשות לחקור את pathophysiology של הפרעות נדידת תאים ולזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית.
חשיפת עור לסוכני אלקילציה (למשל, גופרית וחנקן חרדל) גורמת ריפוי פצע הפרעה 6. תרכובות כאלה היו בשימוש כחומרי לחימה כימית במספר עימותים במאה ה -20 ולהישאר סיבה לדאגה חזקה בשל מאגרים קיימים באזורים לא יציבים מבחינה פוליטית וסינתזה פשוטה יחסית. למרות שגז החרדל היה מסונתז ראשון בשנת 1822, פתולוגיה המולקולרית והקלינית של חשיפת SM אינה מובנת בפירוט ולא תרופה לחשיפת SM זוהתה.
מספר מחקרים שנערכו להבין ומודל ריפוי פצע לקוי לאחר חשיפת SM ולבדוק לתרכובות מועמד פוטנציאליות מסוגלים להזמין השפעה ש. שמידט ואח '. (2009) בדק את ההשפעה של כלוראמבוציל, מתחם אלקילציה עם מאפיינים דומים לSM בmouדגמי SE גוף embryoid ומצא לפעמים ירידה בהיווצרות כלי 7 דרמטית, יותר מ 99%. השפעה שלילית זו בולטת ביותר בשלב של פיתוח אשר, בתנאים פיסיולוגיים, הוא נשלט על ידי ההתפשטות והנדידה של תאי האנדותל של כלי דם מבשר. כך, תאים אלה זוהו להיות רגישים במיוחד לאלקילציה סוכנים. Steinritz et al. (2010) נבדק אוכלי נבלות של מיני חמצן מגיבים (ROS), ב, N-acetylcysteine מסוים (NAC) וחומצת אלפא לינולנית (ALA) ביכולתם להפחית את רעילות SM במודלי גוף עכבר embryoid ובפרט, ל לשחזר היווצרות כלי 8. השפעות מגנות זמניות נצפו, מצביעה על כך שהיווצרות ROS מוגזמת עשוי לתרום להשפעות השליליות של SM בריפוי פצעים. תופעות אלה לא היו קבועות ותרכובות שני המועמד לא יכולות להיות מסוגלים להחזיר היווצרות כלי וריפוי פצע בטווח הארוך 8. However, ניסויים אלה בוצעו במודל 3D מורכב שעשה יאפשר חקירה של נדידת תאים. לפיכך, אנו לאחר מכן נבדקו NAC וALA להשפעות מועילות על נדידת תאים של השוק האירופי המשותף שיש להם תפקיד מפתח בתהליך של היווצרות כלי 9.
יתר על כן, יש ראיות כי קוטביות התא נדרש לנדידת תאים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המובילה להיווצרות ROS הוצג לפגוע בקוטביות תא ועלול להשפיע לרעה על כך נדידת תאים. לכן, הדמיה תא חי בכל קשור לתפקוד המיטוכונדריה בוצעה ואת ההשפעות של אוכלי נבלות ROS נבדקו. הפרוטוקול הבא מתאר דרישות כלליות לגידול של השוק האירופי המשותף, assay קאמרי בוידן, ריפוי הפצע assay כולל ניתוח מעקב תא והשימוש בTMRM להערכה של תפקוד המיטוכונדריה בפירוט. היבטים חשובים של פרוטוקולי ניסוי לגידול וההגירה EEC מודגשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשיפת עור לחומרים כימיים רעילים לעתים קרובות תוצאות הפרעה בריפוי פצע חמורה. המנגנונים הם במידה רבה לא ידועים. ריפוי פצע הוא תהליך מורכב הכולל שלבים שונים (עצירת דימום, דלקת, שגשוג ושיפוץ). נדידת תאים מעורבת בכל שלב, לעומת זאת, זה הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת רקמת פרור. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
