تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
التعرض للمواد الكيميائية (بما في ذلك مؤلكل عوامل الحرب الكيميائية مثل الكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب عدد كبير من الأعراض السريرية بما في ذلك الجرح اضطراب الشفاء. عملية فسيولوجية التئام الجروح معقدة للغاية. تشكيل النسيج الحبيبي هو خطوة أساسية في هذه العملية مما أدى إلى إغلاق الجرح الأولي وتوفير شبكة من الأوعية الدموية الشعرية الجديدة – إما عن طريق تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تنتشر السفن الموجودة). كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب وظيفية، والهجرة الموجهة من الخلايا البطانية. وهكذا، والتحقيق في وقت مبكر من الخلايا البطانية (EEC) الهجرة غير المهم أن نفهم الفيزيولوجيا المرضية من المواد الكيميائية الناجمة عن التئام الجروح الاضطرابات ويحتمل أن تحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.
قمنا بتقييم ضعف التئام الجروح بعد مؤلكل التعرض لعامل واختبار المركبات المرشحة المحتملة للجراراتeatment. كنا مجموعة من التقنيات الواردة في هذا البروتوكول. A غرفة بويدن المعدلة للتحقيق من الناحية الكمية يوصف تنشيط كيميائي من EEC. وعلاوة على ذلك، ويتضح استخدام التئام الجروح فحص في تركيبة مع تحليل المسار لتقييم نوعيا الهجرة. أخيرا، علينا أن نظهر استخدام TMRM صبغة الفلورسنت للتحقيق في احتمال غشاء الميتوكوندريا إلى تحديد الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا المضطربة. يصف بروتوكول التالية التقنيات الأساسية التي تم تكييفها للتحقيق في EEC.
Introduction
هجرة الخلايا مهمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك تطوير والأمراض المختلفة، والتئام الجروح بعد إصابة الجلد.
بعد إصابة الجلد، التهاب الأنسجة ويزيل تحبيب محركات الأقراص التالفة أو الميتة إغلاق الجرح الأولي ويسمح تشكيل شبكة من الشعيرات الدموية الجديدة من خلال تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تبرعم الحويصلات الموجودة) 1-3. كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب هجرة الخلايا البطانية. شبكة متنامية من الأوعية الدموية أمر ضروري لنقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا الكيراتينية المتكاثرة التي تخضع في نهاية المطاف التقرن، تشكيل ظهارة جديدة وتوفير إغلاق الجرح.
الهجرة ضعف الخلايا البطانية هو السبب الكامن وراء الجرح اضطراب 4،5 الشفاء. ويلزم بذلك، وأساليب تقييم هجرة الخلايا البطانية في وقت مبكر لاستكشاف pathophysiolتتبناها من اضطرابات الهجرة الخلية وتحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.
تعرض البشرة للعوامل مؤلكل (على سبيل المثال، والكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب الجرح اضطراب 6 الشفاء. واستخدمت هذه المركبات كما عوامل الحرب الكيميائية في العديد من الصراعات في القرن 20 ويبقى سبب قلق شديد بسبب المخزونات الموجودة في المناطق غير المستقرة سياسيا وتركيب بسيط نسبيا. على الرغم من خردل الكبريت تم تصنيعه لأول مرة في عام 1822، ليست مفهومة علم الأمراض الجزيئية والسريرية التعرض SM في التفاصيل، ويتم تحديد أي ترياق للتعرض SM.
وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم ونمذجة ضعف التئام الجروح بعد التعرض SM واختبار المركبات المرشحة المحتملة قادرة على الاحتفاظ بهذا المعنى. شميت وآخرون (2009) اختبار تأثير الكلوراميوسيل، وهو مركب مؤلكل مع خصائص مشابهة لSM في مذكرة التفاهمحد ذاتها نماذج الجسم مضغي وجدت مثيرة، وأحيانا للحد من أكثر من 99٪ في تكوين الاوعية 7. كان هذا تأثير سلبي أكثر وضوحا في مرحلة التنمية التي، في ظل الظروف الفسيولوجية، يهيمن عليها انتشار وهجرة الخلايا السلائف بطانة الأوعية الدموية. وهكذا، تم تحديد هذه الخلايا لتكون حساسة بشكل خاص لمؤلكل الوكلاء. Steinritz وآخرون (2010) اختبار الزبالين من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، ولا سيما، N أسيتيل (NAC) وحمض اللينولينيك ألفا (ALA) لقدرتها على تقليل SM سمية في الماوس مضغي نماذج الجسم وعلى وجه الخصوص، ل استعادة تكوين الاوعية 8. وقد لوحظت آثار وقائية مؤقتة، مشيرا إلى أن تشكيل ROS المفرط على الأرجح تساهم في الآثار السلبية لSM على التئام الجروح. وكانت هذه الآثار يست دائمة وربما لا تكون المركبات مرشح اثنين قادرة على استعادة تكوين الاوعية والتئام الجروح على المدى الطويل 8. Howeveص، أجريت تلك التجارب في نموذج 3D المعقدة التي لم تسمح التحقيق في الهجرة الخلية. وبالتالي، نحن اختبار في وقت لاحق NAC وALA للآثار مفيدة على هجرة الخلايا من EEC التي لها دور أساسي في عملية تكوين الاوعية 9.
وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلية القطبية مطلوب للهجرة الخلية. وقد أظهرت ضعف الميتوكوندريا مما يؤدي إلى تشكيل ROS مخلا قطبية الخلية وبالتالي قد تؤثر سلبا على الهجرة الخلية. لذلك، تم إجراء تصوير الخلايا الحية فيما يتعلق ظيفة الميتوكوندريا وتم فحص آثار الزبالين ROS. يصف بروتوكول التالية المتطلبات العامة للزراعة EEC، وغرفة فحص بويدن، والتئام الجروح مقايسة بما في ذلك تحليل تتبع الخلية واستخدام TMRM لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في التفاصيل. ويسلط الضوء على جوانب هامة من البروتوكولات التجريبية لزراعة الجماعة الاقتصادية الأوروبية والهجرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعرض البشرة للمواد الكيميائية السامة غالبا ما يؤدي إلى اضطراب شديد التئام الجروح. الآليات الكامنة غير معروفة إلى حد كبير. التئام الجروح هو عملية معقدة تتكون من مراحل مختلفة (الارقاء، والتهاب، وانتشار وإعادة عرض). وتشارك الهجرة خلية في كل مرحلة، ومع ذلك، فإنه من الأهم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
