Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
L'exposition à des substances chimiques (y compris les agents alkylants de guerre chimiques tels que les moutardes à l'azote et soufre) provoque une grande variété de symptômes cliniques, y compris le trouble de guérison de la plaie. Le processus physiologique de cicatrisation de la plaie est très complexe. La formation de tissu de granulation est une étape clé dans ce processus résultant dans un avant fermeture de la plaie et de fournir un réseau de nouveaux vaisseaux sanguins capillaires – soit par vasculogenèse (formation de roman) ou angiogenèse (la germination des navires existants). Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse fonctionnel, la migration dirigée des cellules endothéliales. Ainsi, l'enquête du début de cellules endothéliales (CEE) la migration est important de comprendre la physiopathologie de la plaie chimique induite par les troubles de guérison et de potentiellement identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.
Nous avons évalué la guérison des plaies après alkylation exposition de l'agent et testé des composés candidats potentiels pour traitement. Nous avons utilisé un ensemble de techniques décrites dans ce protocole. Une chambre de Boyden modifiée pour enquêter quantitativement chimiokinèse des CEE est décrite. En outre, l'utilisation de la cicatrisation dosage en combinaison avec l'analyse de piste afin d'évaluer qualitativement la migration est illustré. Enfin, nous démontrons l'utilisation de la TMRM de colorant fluorescent pour l'enquête du potentiel de membrane mitochondriale pour identifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbé. Le protocole suivant décrit les techniques de base qui ont été adaptés pour l'étude des CEE.
Introduction
La migration cellulaire est important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques y compris le développement, diverses maladies, et la cicatrisation après une blessure de la peau.
Après une lésion de la peau, une inflammation des tissus durs supprime granulation et endommagées ou nécrotiques préliminaire fermeture de plaie et permet la formation d'un réseau de nouveaux capillaires à travers la vasculogenèse (formation novel) ou l'angiogenèse (bourgeonnement de vésicules existants) 3.1. Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse migration des cellules endothéliales. Le réseau croissant de vaisseaux sanguins est essentielle pour le transport de l'oxygène et des nutriments à la prolifération des kératinocytes qui subissent finalement kératinisation, former un nouvel épithélium et de fournir fermeture de la plaie.
La migration des cellules endothéliales avec facultés affaiblies est une cause sous-jacente de cicatrisation 4,5 trouble. Ainsi, les méthodes pour évaluer la migration des cellules endothéliales premiers sont nécessaires pour explorer le pathophysiolgie des troubles de la migration cellulaire et d'identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.
L'exposition cutanée aux agents alkylants (par exemple, de soufre et d'azote moutardes) provoque la cicatrisation trouble 6. Ces composés ont été utilisés comme agents de guerre chimique dans plusieurs conflits dans le 20ème siècle et restent raison de vives préoccupations en raison de stocks existants dans des régions politiquement instables et la synthèse relativement simple. Bien que le gaz moutarde a été synthétisé pour la première en 1822, la pathologie moléculaire et clinique de l'exposition SM ne soit pas compris dans le détail et aucun antidote pour l'exposition SM a été identifié.
Plusieurs études ont été menées afin de comprendre et de modéliser la guérison des plaies après une exposition de SM et de tester des composés candidats potentiels capables de réserver cet effet. Schmidt et al. (2009) ont testé l'effet de chlorambucil, un composé alkylant avec des propriétés similaires à SM dans mousoi modèles de corps embryoïdes et trouvé une dramatique, réduction parfois plus de 99% dans la formation de vaisseaux 7. Cet effet indésirable est le plus prononcé à un stade de développement qui, dans des conditions physiologiques, est dominé par la prolifération et la migration des cellules précurseurs endothéliales vasculaires. Ainsi, ces cellules ont été identifiés comme étant particulièrement sensible aux agents d'alkylation. Steinritz et al. (2010) ont testé piégeurs de formes réactives de l'oxygène (ROS), en particulier, la N-acétylcystéine (NAC) et de l'acide alpha-linolénique (ALA) pour leur capacité à réduire la toxicité SM dans les modèles de l'organisme de la souris embryoïdes et en particulier, à restaurer la formation de vaisseaux 8. Effets protecteurs temporaires ont été observés, ce qui indique que la formation excessive ROS était susceptible de contribuer aux effets néfastes de SM sur la cicatrisation. Ces effets ne sont pas permanentes et les deux composés candidats peuvent ne pas être capable de restaurer la formation des vaisseaux et la cicatrisation dans le long terme 8. However, ces expériences ont été menées dans un modèle 3D complexe qui a fait de permettre une enquête de la migration cellulaire. Ainsi, nous avons ensuite testé CNA et de l'ALA pour les effets bénéfiques sur la migration des cellules de la CEE qui ont un rôle clé dans le processus de la formation de vaisseaux 9.
En outre, il est prouvé que la polarité cellulaire est nécessaire pour la migration des cellules. Dysfonction mitochondriale conduisant à la formation de ROS a été montré à porter atteinte à la polarité cellulaire et peut donc nuire à la migration cellulaire. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes à l'égard de la fonction mitochondriale a été effectuée et les effets de charognards ROS ont été examinés. Le protocole suivant décrit les exigences générales pour la culture de la CEE, le dosage de la chambre de Boyden, la cicatrisation dosage y compris l'analyse de suivi de la cellule et l'utilisation de TMRM pour l'évaluation de la fonction mitochondriale en détail. Les aspects importants de protocoles expérimentaux pour la culture et la migration CEE sont mis en évidence.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'exposition cutanée à des produits chimiques toxiques se traduit souvent par des troubles de cicatrisation sévère. Les mécanismes sous-jacents sont largement inconnues. La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui se compose de différentes phases (hémostase, inflammation, prolifération et remodelage). La migration cellulaire est impliquée dans toutes les étapes, cependant, il est de la plus haute importance pour la formation du tissu de granulation. Ici, de nouveaux vaisseaux sanguins sont fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
