Вирусный-опосредованной маркировки и трансплантации медиальной ганглиозные Высокопреосвященства (MGE) Клетки для<em> В Vivo</em> Исследования
Summary
ГАМКергические корковых интернейронов предшественники разойтись, разработать и синаптически интегрироваться в принимающей мозга после трансплантации. Эти клетки могут быть легко трансдуцировали перед трансплантацией для исследований в естественных условиях генетически модифицированных предшественников ГАМК. Здесь мы покажем, вирусные методы маркировки для решения конкретных интерней- подгруппы, используя существующие CRE линии и Cre-зависимых журналистам.
Abstract
ГАМКергические корковых интернейронов, полученные из эмбриональных медиальной и хвостового ганглиозных возвышения (MGE и КГЭ), функционально и морфологически разнообразны. INROADS были сделаны в понимании роли различных корковых интернейронов подгрупп, однако, есть еще многие механизмы должны быть разработаны, которые могут внести свой вклад в развитие и созревание различных типов ГАМК клеток. Кроме того, изменены сигнализации ГАМК может способствовать фенотипов аутизма, шизофрении и эпилепсии. Конкретные направления Cre-драйвера начали разбазаривать функции уникальных интернейронных подгрупп. Несмотря на успехи в мышиных моделях, часто бывает трудно эффективно исследовать ГАМКергических интернейронов коры головного мозга предшественников с молекулярными подходов в естественных условиях. Один важный метод для изучения клеток автономного программирования этих клеток трансплантация MGE клеток в принимающих коры. Эти пересаженные клетки мигрируют широко, дифференцировать,й функционально интегрироваться. Кроме того, MGE клетки могут быть эффективно трансдуцированных лентивирусов непосредственно перед трансплантацией, позволяя множеству молекулярных подходов. Здесь мы подробно протокол эффективно трансдуцировать MGE клетки перед трансплантацией для анализа в естественных условиях, с использованием имеющихся линий Cre-драйвера и Cre-зависимых векторов экспрессии. Этот подход имеет преимущество, поскольку он сочетает в себе точное генетическое манипулирование с возможностью этих клеток для диспергирования после трансплантации, что позволяет более конкретное решение камерного типа в естественных условиях.
Introduction
ГАМКергические корковых интернейронов содержат ~ 20-30% нейронов в коре головного мозга млекопитающих, в то время как остальные соответствуют нервной, глутаматергические основные нейроны. Интернейроны весьма разнообразны электрофизиологических свойств, аксона и дендритов морфологии и синаптических таргетирования 1, и дисбаланс в нервной / ингибиторного тона предположили лежать в основе некоторых фенотипов неврологических / нервно-психических расстройств, включая аутизм, шизофрения и эпилепсия 2. Общая цель протокола, описанного в настоящем документе, чтобы обеспечить средства, чтобы эффективно генетически модифицировать ГАМКергических интернейронов коры перед трансплантацией клеток-предшественников для анализа в естественных условиях.
Корковая ГАМКергические интернейронов рождаются в медиальных и хвостового ганглиозных возвышения (MGE и КГЭ соответственно) 3,4, а также преоптическом 5. Кортикальные интерней- предшественники переносу на большие расстояния по касательной миграции с последующимрадиальной миграции для достижения своих конечных целей. По прибытии в пункт назначения, эти корковые интернейронов необходимо правильно интегрировать в существующую сеть нейронов, и каждый уникальный интерней- подгруппа будет способствовать корковой схемы в конкретных отношениях. Четыре основные подгруппы можно отличить по молекулярным маркерам: MGE, полученных соматостатина (SST) + и парвальбумина (PV) + подгруппы, и КГЭ, полученных вазоактивный кишечный пептид (VIP) + и Рилин +; SST – подгруппы 6. Различные корковые интерней- подгруппы рождаются по различным раза во время эмбрионального развития в MGE и КГЭ 7, 8. Эти и другие корковые ГАМКергические интерней- маркеры были использованы для создания определенной линии Cre-драйвера для многих из этих подгрупп 9-11.
Трансплантация MGE предшественников стала потенциальной клеточной терапии для лечения заболеваний, которые могут быть вызваны дисбалансомв возбуждения / торможения 12 – 24. Эти терапевтические преимущества могут быть отчасти из-за уникальной способности MGE предшественников (для разгона, дифференцировать и интегрировать в принимающей мозга), или потенциально, потому что многие пригородных соматические ингибирующее PV + клетки получают из MGE. MGE клетки также могут быть быстро и эффективно трансдуцированных лентивирусов перед трансплантацией 15, что позволяет клетки, генетически модифицированные в пробирке быть изучены в естественных условиях. Причиной разработки этого подхода в том, чтобы преодолеть препятствия в изучении GABAergic развития коры межнейронных и созревание. В частности, трансплантация MGE позволило исследователям изучить развитие мутантных клеток в естественных условиях, когда мутантных мышей имели бы умерли в раннем момент времени. Кроме того, путем введения генов, представляющих интерес перед трансплантацией, эффекты специфических генов на фенотип мутантного может быть оценена в эффциент образом.
Здесь мы предоставляем подробный протокол трансдуцировать MGE клетки лентивирусы до трансплантации. Кроме того, показано, как этот метод может быть адаптирован для экспрессии интересующего гена в конкретных интернейронов подгрупп из гетерогенной группе кортикальных предшественников интернейронов, используя комбинацию Cre-зависимых лентивирусов экспрессии и доступных линий мышей Cre-драйвера. Кроме того, этот протокол вводит методы и платформы для исследователей генетически модифицировать ГАМКергические корковых интернейронов предшественники для естественных условиях исследования в в уникальном пути. Одним из преимуществ этого метода по сравнению с другими текущими подходами в том, что трансплантированные клетки MGE разгона от места инъекции. Кроме того, в отличие от координационных вирусных инъекций, после MGE клетки расходятся их морфология легче оценить. Этот подход может быть использован для изучения влияния введения генов, представляющих интерес в дикого типа или мутантных клеток, представляя тип клеток конкретныхрепортер, чтобы оценить морфологию, или потенциально, чтобы изучить влияние аллелей болезни в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование GABAergic прекурсоров корковых интернейронов из эмбриональных ганглиозных возвышения (GES) для сотовых терапии на основе показывает обещание для многих условий 12 -1 4. Точные молекулярные методы необходимы, чтобы отслеживать и выразить интерес генов в конкретных интерне…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами на JLRR от: Аутизм Говорит, Нина Ирландия, Weston Пристани Фонд, NiMH R01 MH081880 и NIMH R37 MH049428. PRW была поддержана общение Национального научного совета Тайваня. SFS была поддержана F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
