Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler<em> İn Vivo</em> Çalışmalar
Summary
GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.
Abstract
Embriyonik medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve CGE) türetilen GABAerjik kortikal internöron, işlevsel ve morfolojik çeşitlidir. Yayılmakta farklı kortikal interneuron alt rollerini anlamada yapılmış, ancak, GABA farklı hücre tiplerinin gelişmesi ve olgunlaşması için katkıda bulunabilir çalışılması gerektiğini hala birçok mekanizma vardır. Ayrıca, değiştirilmiş GABA sinyal, otizm, şizofreni ve epilepsi fenotipleri katkıda bulunabilir. Spesifik Kre-sürücü hatları eşsiz interneuron alt fonksiyonlarını dışarı parsel başladı. Fare modellerinde ilerlemelere rağmen, verimli in vivo moleküler yaklaşımlar GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır çalışma genellikle zordur. Bu hücrelerin hücre özerk programlama incelemek için kullanılan önemli bir tekniktir konak korteks içine MGE hücrelerinin nakli olduğunu. Bu nakledilen hücrelerin ayırt, yoğun göç, birnd işlevsel entegre. Buna ek olarak, MGE hücreleri verimli bir şekilde moleküler yaklaşımlar çok sayıda imkan veren, transplantasyondan hemen önce lentivirüs ile transduse edilebilir. Burada mevcut Kre-sürücü hatları ve Kre-bağımlı ifade vektörleri kullanılarak, detay verimli in vivo analiz için transplantasyon öncesi MGE hücreleri nakletmek için bir protokol biz. Bu, in vivo olarak daha büyük bir hücre türüne özgü çözünürlüğe izin verecek şekilde nakli sonrası dağıtmak için bu hücrelerin yeteneği ile kesin genetik işleme birleştirir, bu yaklaşım, avantaj sağlamaktadır.
Introduction
Dinlenme, glutamaterjik temel nöronlar uyarıcı karşılık ise GABAerjik kortikal internöron, memeli neokorteks nöronların ~% 20-30 içermektedir. Internöron elektrofizyolojik özellikleri, akson ve dendrit morfolojisi ve 1 hedefleme sinaptik oldukça çeşitlidir, ve uyarıcı / inhibitör tonda dengesizlikler otizm, şizofreni ve epilepsi gibi nörolojik 2 / nöropsikiyatrik bozuklukların bazı fenotipleri altında yatan varsayılmaktadır. Burada açıklanan protokol genel amacı verimli genetik in vivo analizler için transplantasyon öncesi GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır değiştirmek için bir araç sağlamaktır.
Kortikal GABAerjik internöron medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve sırasıyla CGE) 3,4 yanı sıra preoptik alanda 5 doğarlar. Kortikal interneuron atalarıdır uzun mesafe teğet göç takip geçmesiradyal göç ederek nihai hedeflerine ulaşmak için. Hedeflerine varışta, bu kortikal internöron doğru mevcut nöronal ağ içine entegre olmalı, ve her benzersiz interneuron alt grup belirli şekillerde kortikal devre katkıda bulunacaktır. Dört ana alt gruplar moleküler belirteçlerin tarafından ayırt edilebilir: MGE-türetilmiş somatostatin (SST) + ve parvalbumin (PV) + alt gruplar ve CGE-türetilmiş vazoaktif intestinal peptid (VIP) + ve Reelin +; SST – alt grupları 6. Farklı kortikal interneuron alt grupları MGE ve CGE 7, 8 embriyonik gelişimi sırasında değişik zamanlarda doğar. Bu ve diğer kortikal GABAerjik interneuron işaretleri bu alt 9-11 çok özel Cre sürücü soyları meydana getirmek için kullanıldı.
MGE progenitörlerin nakli dengesizliklerinin neden olabilir bozuklukları tedavi etmek için potansiyel bir hücre bazlı terapi olarak ortaya çıkmıştır12-24 uyarma / inhibisyonu. Bunlar, tedavi edici yararları çok peri-somatik önleyici PV + hücreleri MGE elde edilir (ayırt etmek ve bir konakçı beyin entegre dağıtmak için), ya da potansiyel nedeniyle MGE progenitörlerinin eşsiz kabiliyetlerine bağlı olabilir. MGE hücreleri aynı zamanda genetik olarak in vitro olarak modifiye edilmiş hücreler, in vivo olarak incelenmesi gereken sağlayan hızlı ve verimli bir şekilde nakli 15 önce lentivirüsler ile transduse olabilir. Bu yaklaşım geliştirmek için gerekçe GABAerjik kortikal interneuron gelişimini ve olgunlaşmasını okuyan barikatlar üstesinden oldu. Özellikle, MGE transplantasyonu mutant fare başka türlü erken zaman noktasında öldü ne zaman araştırmacılar, in vivo, mutant hücrelerinin gelişimini çalışmalarına izin vermiştir. Ayrıca, transplantasyon öncesinde ilgi genlerin katılmasıyla, bir mutant fenotipe spesifik genlerin etkileri, eff olarak değerlendirilebiliricient şekilde.
Burada, biz transplantasyon öncesinde lentivirüsler MGE hücreleri nakletmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, bu teknik, Kre-bağlı sentezleme lentivirüsler ve veriler Cre sürücü fare hatları bir kombinasyonu kullanılarak, kortikal interneuron ön ait heterojen bir gruba belirli interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek üzere adapte edilebilir göstermektedir. Genetik benzersiz bir şekilde in vivo çalışmalar için GABAerjik kortikal interneuron öncülerini değiştirmek Üstelik, bu protokol teknikleri ve araştırmacılar için bir platform sunuyor. Diğer güncel yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin bir avantajı nakledilen MGE hücreleri uzak enjeksiyon yerinde dağıtmak olacaktır. Ayrıca, fokal, viral enjeksiyondan farklı MGE hücreleri dağıtmak sonra morfoloji değerlendirmek kolaydır. Bu yaklaşım, belirli bir hücre tipi sokulması, vahşi tip veya mutant hücrelerine ilgi genleri verme etkisini incelemek için kullanılabilirmuhabir in vivo hastalık alel etkisini incelemek için potansiyel morfoloji değerlendirmek, ya da.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre bazlı tedaviler için embriyonik ganglion eminences (GEs) den GABAerjik kortikal interneuron öncülerinin kullanımı birçok koşulları 12 -1 4 için umut gösteriyor. Hassas moleküler teknikler etiket ve belirli interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için ihtiyaç vardır. Burada transplantasyonundan önce lentivirüsler embriyonik MGE hücrelerin etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar ve bu yöntem, in vivo analiz için özel kortikal interneuron alt ilgi genleri ifade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma dan JLRR hibe ile desteklenmiştir: Otizm Konuşuyor, Nina İrlanda, Weston Havens Vakfı, NIMH R01 MH081880 ve NIMH R37 MH049428. Prw Tayvan Ulusal Bilim Konseyi bir burs ile desteklenmiştir. SFS F32 (MH103003) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
