Viraal-gemedieerde Labeling en Transplantatie van Medial ganglion Eminence (MGE) Cellen voor<em> In Vivo</em> Studies
Summary
GABAergische corticale interneuron voorouders te verspreiden, te ontwikkelen en synaptically integreren in een gastheer cortex na transplantatie. Deze cellen kunnen gemakkelijk worden getransduceerd voor transplantatie in vivo studies van genetisch gemodificeerde GABAerge precursoren. Hier tonen we virale etikettering technieken om specifieke interneuron subgroepen met behulp van bestaande Cre lijnen en Cre-afhankelijke verslaggevers richten.
Abstract
GABAergische corticale interneuronen, afgeleid van de embryonale mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE), zijn functioneel en morfologisch divers. Vooruitgang hebben geboekt in het begrijpen van de rol van afzonderlijke corticale interneuronen subgroepen, maar er zijn nog vele mechanismen worden uitgewerkt die kunnen bijdragen aan de ontwikkeling en rijping van verschillende GABAerge cellen. Bovendien kan veranderd GABAerge signalering bijdragen aan fenotypen van autisme, schizofrenie en epilepsie. Specifieke Cre-driver lijnen zijn begonnen met het verkavelen van de functies van unieke interneuron subgroepen. Ondanks de vooruitgang in muismodellen, is het vaak moeilijk om efficiënt studeren GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen met moleculaire benaderingen in vivo. Een belangrijke techniek die gebruikt wordt om de cel autonome programmering van deze cellen te bestuderen is transplantatie van MGE cellen in gastheer cortex. De getransplanteerde cellen migreren uitgebreid, differentiëren, eennd functioneel integreren. Bovendien kunnen MGE cellen efficiënt worden getransduceerd met lentivirus onmiddellijk voorafgaand aan transplantatie, waardoor een veelheid aan moleculaire benaderingen. Hier hebben we detail een protocol om efficiënt transduceren MGE cellen voor transplantatie voor in vivo analyse, met behulp van beschikbare Cre-driver lijnen en Cre-afhankelijke expressie vectoren. Deze benadering is voordelig omdat het een combinatie nauwkeurige genetische manipulatie het vermogen van deze cellen te verspreiden na transplantatie, waardoor grotere celtype bepaalde resolutie in vivo.
Introduction
GABAerge corticale interneuronen omvatten ~ 20-30% van neuronen in het zoogdier neocortex, terwijl het overige overeen met prikkelende, glutamaat OG neuronen. Interneuronen zijn zeer divers in elektrofysiologische eigenschappen, axon en dendriet morfologie en synaptische targeting 1, en onevenwichtigheden in prikkelende / remmende toon worden verondersteld om een aantal fenotypes van neurologische / neuropsychiatrische aandoeningen zoals autisme, schizofrenie en epilepsie 2 ten grondslag liggen. Het algemene doel van de hierin beschreven protocol is een middel om GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen efficiënt genetisch modificeren vóór transplantatie in vivo analyse te verschaffen.
Corticale GABAergische interneuronen zijn geboren in de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE, respectievelijk) 3,4 evenals de preoptic gebied 5. Corticale interneuron voorouders ondergaan lange afstand tangentiële migratie gevolgddoor radiale migratie naar hun uiteindelijke doelen te bereiken. Bij aankomst op de plaats van bestemming, moeten deze corticale interneuronen correct te integreren in het bestaande netwerk van neuronen, en elke unieke interneuron subgroep zal bijdragen aan corticale circuits op specifieke manieren. Vier belangrijke subgroepen kunnen worden onderscheiden door moleculaire markers: MGE-afgeleide somatostatine (SST) + en parvalbumine (PV) + subgroepen, en CGE-afgeleide vasoactieve intestinale peptide (VIP) + en Reelin +; SST – subgroepen 6. Verschillende corticale interneuronen subgroepen geboren op verschillende momenten tijdens de embryonale ontwikkeling in de MGE en CGE 7, 8. Deze en andere corticale GABAerge interneuronen merkers zijn gebruikt om specifieke Cre-driver lijnen voor veel van deze subgroepen 9-11 genereren.
De transplantatie van MGE progenitorcellen ontstaan als potentiaalvrij celtherapie stoornissen die kunnen worden veroorzaakt door onbalans behandelenin excitatie / inhibitie 12-24. Deze therapeutische voordelen kunnen deels te wijten aan het unieke vermogen van MGE voorlopers (te verspreiden, differentiëren en integreren in een gastheer hersenen), of potentieel omdat veel peri-somatische remmende PV + cellen afkomstig zijn van de MGE. MGE cellen kunnen ook snel en efficiënt getransduceerd met lentivirussen vóór transplantatie 15, waardoor cellen die genetisch gemodificeerd in vitro worden bestudeerd in vivo. De reden voor de ontwikkeling van deze aanpak was om wegversperringen in het bestuderen GABAergic corticale interneuron ontwikkeling en rijping te overwinnen. Vooral MGE transplantatie liet onderzoekers de ontwikkeling van mutante cellen in vivo onderzoeken bij de mutante muis anders zou gestorven in een vroeg tijdstip. Bovendien, door het introduceren genen van belang voor transplantatie, de effecten van specifieke genen op een mutant fenotype worden vastgesteld bij een efficient manier.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol te MGE transduceren met lentivirussen voorafgaand aan de transplantatie. Daarnaast tonen we hoe deze techniek kan worden aangepast om een gen van belang in specifieke interneuron subgroepen expressie uit een heterogene groep van corticale interneuronen voorlopers, met een combinatie van Cre-afhankelijke expressie lentivirussen en beschikbare Cre-driver muizenlijnen. Bovendien, dit protocol introduceert technieken en een platform voor onderzoekers genetisch GABAerge corticale interneuronen voorlopers in vivo studies wijzigen op een unieke manier. Een voordeel van deze techniek boven andere huidige benaderingen is dat de getransplanteerde cellen MGE weg van de injectieplaats uiteenvalt. Ook, in tegenstelling focale virale injecties, na MGE cellen verspreiden hun morfologie is gemakkelijker te beoordelen. Deze benadering kan worden gebruikt om het effect van het introduceren van genen van interesse in wildtype of mutante cellen introduceren van een celtype specifieke studiereporter morfologie beoordelen of potentieel het effect van ziekte allelen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van GABAergische corticale interneuron voorlopers van de embryonale ganglion grootheden (GET) voor cellen gebaseerde therapieën toont belofte voor vele voorwaarden 12 -1 4. Precieze moleculaire technieken zijn nodig om bij te houden en een automatische genen van belang in specifieke interneuron subgroepen. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het labelen embryonale MGE cellen met lentivirussen vóór transplantatie en hoe deze techniek kan worden gebruikt om genen van interesse in specif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies te JLRR uit: Autism Speaks, Nina Ierland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 en NIMH R37 MH049428. PRW werd ondersteund door een beurs van de National Science Raad van Taiwan. SFS werd ondersteund door F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
