תאי תיוג ותיווך ויראלי השתלה של המדיאלי ganglionic רוממות (MGE) ל<em> In vivo</em> לימודים
Summary
אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפזר, לפתח וsynaptically להשתלב קליפת מארח לאחר השתלה. ניתן transduced תאים אלה בקלות לפני ההשתלה ללימודי in vivo של מבשרי GABAergic מהונדסים גנטי. כאן, אנו מציגים טכניקות תיוג נגיפיות למקד תת-קבוצות interneuron ספציפיות באמצעות קווי Cre קיימים וכתבי Cre-תלויים.
Abstract
interneurons GABAergic קליפת המוח, הנגזרת מהמדיאלי העוברית והוד הזנב ganglionic (MGE וCGE), היא מבחינה תפקודית ומורפולוגית מגוונת. אחיזה נעשתה בהבנת התפקידים של תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron, עם זאת, עדיין יש מנגנונים רבים יש לעבד שעשויה לתרום להתפתחות והתבגרות סוגים שונים של תאי GABAergic של. יתר על כן, איתות GABAergic שינתה עשויה לתרום לפנוטיפים של אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה. קווי Cre-נהג ספציפיים החלו לעטוף את הפונקציות של תת-קבוצות interneuron ייחודיות. למרות ההתקדמות במודלים של עכברים, לעתים קרובות קשה ללמוד אבות interneuron קליפת המוח GABAergic ביעילות עם גישות מולקולריות in vivo. טכניקה חשובה אחד משמשת ללמוד תכנות האוטונומי התא של תאים אלה היא השתלה של תאי MGE לקליפת מוח מארח. תאים מושתלים אלו נעים בהרחבה, להבדיל,nd תפקודי לשלב. בנוסף, תאי MGE ניתן transduced ביעילות עם lentivirus מייד לפני ההשתלה, ומאפשרים למספר רב של גישות מולקולריות. כאן אנו פירוט פרוטוקול לtransduce תאי MGE ביעילות לפני ההשתלה לניתוח in vivo, באמצעות קווי Cre-נהג זמינים ווקטורי ביטוי Cre-תלויים. גישה זו יש יתרון משום שהוא משלב מניפולציה גנטית מדויקת עם היכולת של תאים אלה לפיזור לאחר השתלה, מאפשר רזולוציה מסוימת תאים מסוג גדולה יותר in vivo.
Introduction
interneurons קליפת המוח GABAergic מהווה ~ 20-30% מתאי עצב שבקליפת המוח של היונקים, ואילו השאר מתאים לגירוי, הנוירונים עיקריים glutamatergic. Interneurons מגוונת מאוד בנכסים, האקסון אלקטרו ומורפולוגיה דנדריט והסינפטי מיקוד 1, וחוסר איזון בטון מעכב / מעורר הם שיערו לבסיס כמה פנוטיפים של הפרעות נוירו-פסיכיאטריות / נוירולוגית כוללים אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה 2. המטרה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא לספק אמצעים לשנות ביעילות גנטית אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפני ההשתלה לin vivo ניתוחים.
interneurons קליפת המוח GABAergic נולדות בהוד המדיאלי וזנב ganglionic (MGE וCGE, בהתאמה) 3,4, כמו גם את אזור הקדם-האופטי התיכון 5. אבות interneuron קליפת המוח עוברים הגירה משיקה למרחקים ארוכים ואחריעל ידי הגירת רדיאלי להגיע ליעדים הסופיים שלהם. עם הגעה ליעדים שלהם, interneurons קליפת המוח אלה חייבת בצורה נכונה להשתלב ברשת העצבית הקיימת, וכל תת-קבוצה interneuron ייחודית תתרום למעגלים בקליפת המוח בדרכים מסוימות. ניתן להבחין בארבע קבוצות עיקריות על ידי סמנים מולקולריים: סומטוסטטין נגזר MGE (SST) + וparvalbumin (PV) + תת-קבוצות, ופפטיד נגזר CGE vasoactive מעיים (VIP) + וReelin +; SST – תת-קבוצות 6. תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron נולדות על זמנים שונים במהלך התפתחות עוברית ובMGE 7 CGE, 8. אלה וסמני interneuron אחרים בקליפת המוח GABAergic כבר השתמש כדי ליצור קווי Cre-נהג ספציפיים עבור רבים מתת-קבוצות אלה 9-11.
ההשתלה של תאי אב MGE התפתחה כטיפול מבוסס תאי פוטנציאל לטיפול בהפרעות שעלולות להיגרם על ידי חוסר איזוןבעירור / עיכוב 12-24. יתרונות טיפוליים אלה עשויים להיות נובעים בחלקו את היכולת הייחודית של אבות MGE (לפיזור, להבדיל ולהשתלב במוח מארח), או שעלול להיות בגלל פרי גופני רב PV + תאים מעכבים נגזרים מMGE. תאי MGE יכולים להיות גם transduced מהירות וביעילות עם lentiviruses לפני ההשתלה 15, המאפשרים לתאים שעברו שינוי גנטי במבחנה כדי להיחקר in vivo. הרציונל לפיתוח גישה זו היה להתגבר על מחסומים בלימוד פיתוח GABAergic קליפת המוח interneuron והתבגרות. בפרט, השתלת MGE אפשרה לחוקרים ללמוד את התפתחותם של תאים שעברו מוטציה in vivo, כאשר עכבר המוטציה אחרת היה מת בנקודת זמן מוקדמת. יתר על כן, על ידי החדרת גנים של עניין לפני ההשתלה, את ההשפעות של גנים ספציפיים על פנוטיפ מוטנטי יכולות להיות מוערכים בEFFאופן icient.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לtransduce תאי MGE עם lentiviruses לפני ההשתלה. בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו ניתן להתאים להביע גן של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות מקבוצה הטרוגנית של מבשרי interneuron קליפת המוח, באמצעות שילוב של lentiviruses הביטוי Cre תלוי וקווי עכבר Cre-נהג זמינים. יתר על כן, פרוטוקול זה מציג טכניקות ופלטפורמה לחוקרים לשנות גנטי מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic לin vivo מחקרים בדרך ייחודית. אחד יתרונות של שיטה זו על פני גישות שוטפות אחרות הוא שהתאים המושתלים MGE יתפזרו מאתר ההזרקה. כמו כן, בניגוד לזריקות נגיפיות מוקד, לאחר תאי MGE לפזר המורפולוגיה שלהם קלה יותר להעריך. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של החדרת גנים של עניין לסוג בר או תאים שעברו מוטציה, מציג סוג תא מסויםכתב להעריך מורפולוגיה, או שעלול להיות כדי לחקור את ההשפעה של אללים מחלה in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש של מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic מהוד ganglionic העוברי (GES) לטיפולים בתאים מבוססים מראה הבטחה למצבים רבים 12 -1 4. יש צורך בטכניקות מולקולריות מדויקות כדי לעקוב אחר, ולהביע את הגנים של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתיוג תאים עוב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לJLRR מ: אוטיזם ספיקס, נינה אירלנד, ווסטון נמלי קרן, NIMH R01 MH081880, וNIMH R37 MH049428. PRW נתמכה על ידי מענק מהמועצה הלאומית למדע של טייוואן. SFS נתמכה על ידי F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
