Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

NOTA: Los animales utilizados en este procedimiento se cuidaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices. Ética fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary. 1. Prepare la jeringa para inyección Disolver lisolecitina a una solución al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se almacena a -20 ° C en pequeñas alícuotas (75 l). Descongelar un vial a RT. NOTA: Si lisolecitina es sin disolver, sonicar el tubo en un limpiador ultrasónico (40 kHz) durante aproximadamente 30 min para formar una solución uniforme. Maneje el capilar de vidrio previamente desmenuzado con extremo cuidado para evitar dañar la punta delicada. Aflojar la tuerca de una jeringa de inyección de 10 l e insertarlo en el extremo plano del capilar seguido de 2 casquillos, asegurándose de que los extremos de apareamiento de las férulas se alinean y el capilar esté alineado en el casquillo cónico (Figura 1). Enjuague la jeringa con isopropalcohol il y retire el émbolo. Una vez seco, el tornillo de la mano conjunto de la aguja firmemente en la jeringa de inyección. Coloque la aguja cubo metálico a la jeringa de cebado. Pierce un disco de goma con la aguja y deslice hacia abajo a la base. Llene la jeringa de cebado con lisolecitina. Presione suavemente la jeringa de cebado hasta que el líquido es visible en la punta de la aguja. Esto asegura burbujas de aire no se introducirán en la jeringa de inyección. Inserte la aguja cubo metálico de la jeringa de cebado en la jeringa de inyección. Haciendo un sello firme con el disco de goma, presione lentamente la jeringa de cebado hasta que el capilar se llena hasta la punta con la solución. Retire cuidadosamente la jeringa de cebado mientras que simultáneamente presionando para llenar el barril de la jeringa de inyección sin introducir burbujas de aire. Se inserta el émbolo en la jeringa de inyección y asegúrese de solución fluye desde la punta del capilar cuando el émbolo se presiona suavemente. NOTA: Si las burbujas de aire son visibles en la tapaIllary o inyección de la jeringuilla, la preparación de la jeringa debe repetirse desde el principio. Fluido continuo en el aparato de inyección es fundamental para garantizar los volúmenes de inyección precisos. Coloque la jeringa de inyección completado al brazo de un micromanipulador estereotáctica. Este aparato completado será capaz de inyectar 15 a 20 animales antes de necesitar ser recargado. Deseche la lisolecitina restante de la jeringa de cebado. Retirar y deprimir alcohol isopropílico varias veces, y separar la aguja cubo metálico. Espere varias horas para el alcohol isopropílico restante en la jeringa de cebado para evaporar antes de llenar de nuevo. 2. Prepare Animal de Procedimiento Quirúrgico NOTA: Este procedimiento se describe para mujeres C57BL / 6 ratones, con edades entre 8-10 semanas. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) o por las regulaciones de cuidado animal institucionales. Plan para elanimales sea bajo anestesia durante aproximadamente 1 hora si se utiliza anestesia inyectable. Prueba de que el animal está profundamente anestesiado apretando firmemente el pie. Un animal de adecuadamente anestesiado no responderá a la pizca. El uso de máquinas de cortar, afeitarse un cm2 de área de 2-3 en la parte dorsal del animal, cerca de los oídos. Tenga cuidado de no dañar los oídos. Limpie el área con etanol al 70% aplicado a una gasa. Asegúrese de que todo el pelo recortado ha sido retirado de la zona. Desinfectar la zona con yodo. Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante todo el procedimiento. Mantenga el animal en una cámara de recuperación calienta hasta que esté listo para comenzar el procedimiento. 3. Lleve a cabo el procedimiento quirúrgico NOTA: Asegúrese de que la técnica aséptica adecuada para todos los pasos del procedimiento. Esto incluye el uso adecuado de guantes, redecillas para el cabello, mascarillas y cortinas. Todas las herramientas deben ser esterilizados antes de entrar en contact con el animal. Mueva el animal a un marco estereotáxico, lado dorsal hasta, elevado en la sección media de toallas de papel plegadas a exagerar la curvatura de la columna vertebral. Fijar los brazos y la cola con cinta quirúrgica y asegurar la cabeza con una pinza diente. Barras estabilizadoras del oído no son necesarios para este procedimiento. Utilice un bisturí para realizar una incisión en la línea media 3 cm, comenzando justo debajo de las orejas y de corte en la dirección caudal. Localice la brecha entre los 2 grandes estructuras adiposas y utilizar unas pinzas finas en cada mano para tirar de ellos aparte. Spread retractores para abrir el campo quirúrgico. Bajo un microscopio quirúrgico, busque el proceso consecuencia destacada de la vértebra T2 (Nota: esta función es característico de la cepa C57BL / 6 mouse). Realice una disección roma con tijeras de primavera cerrados a través de la musculatura de revestimiento a visualizar mejor T2. Usando las pinzas, sentir por las superficies duras de T3 y T4 para confirmar la ubicación anatómica correcta. Usando tijeras de primavera, hacer cortes laterales poco profundas (2-3 mm de profundidad) del tejido conectivo entre T3 y T4. Debido a la separación natural entre las vértebras en la porción torácica superior de la columna vertebral ratón, una laminectomía no es necesario para revelar la médula espinal. Tenga en cuenta que un corte demasiado profundo perforará y dañar el cable. NOTA: Un pequeño grado de sangrado es común durante esta etapa. Si esto ocurre, mantenga una lanza esponja en el área hasta que cese el sangrado (30-60 seg). Visualizar la médula espinal. Se cubrió con una gruesa capa de duramadre visible si esta capa meníngea aún no se cortó mientras se expone el cable. Un vaso sanguíneo prominente corre caudal / rostral a través de la línea media aproximada de la médula espinal. NOTA: Este vasculatura no se debe utilizar como un punto de referencia para la línea media. En cambio, una iluminación adecuada debe revelar los límites de materia gris-blanco que flanquean la columna dorsal, y éstos deben ser utilizados para estimar la línea media. Si la duramadrepermanece intacto, hacer raspaduras laterales suaves con una aguja de metal G 32 hasta que se borra. El objetivo es eliminar la duramadre cuando no esté cortando las meninges subyacentes restantes, que no son tan gruesas y más difícil de ver. NOTA: La liberación de líquido cefalorraquídeo indica una violación de la aracnoides y si bien esto puede ocurrir sin daños mecánicos a los tejidos, el líquido cefalorraquídeo acumulado debe ser eliminado con una lanza esponja para visualizar mejor la superficie del cordón. Mueva la jeringa de inyección en su lugar y baje lentamente hasta que la punta del capilar apenas toca la médula espinal inmediatamente lateral de cada lado de la línea media. Bloquear el brazo en su lugar. Usa las mediciones graduales del brazo estereotáxica en la dirección Z para hacer una medición de la posición de línea de base. De esta lectura, restar 1,3 mm. Use un movimiento a la baja rápida y poco profunda para perforar el tejido y luego baje con cuidado el capilar hasta alcanzar la nueva medición. Opcional: Si lo desea,lesiones en la columna de la dorsal pueden ser producidos por el mismo movimiento de perforación en la línea media y una profundidad de 0,3 mm (véase la discusión para más información). NOTA: Estos valores son específicos para inyectar entre T3 y T4. Si optar para realizar la inyección en cualquier otro lugar en la médula espinal, estos valores deben ser derivados de cualquier atlas de cerebro de ratón disponibles. Utilice el micromanipulador para deprimir lisolecitina en la sustancia blanca de la médula espinal ventral. Hacer 1 rotación del micromanipulador cada 5 s durante 2 min, lo que resulta en un volumen final de 0,5 l. Deje el capilar en lugar de 2 minutos adicionales para evitar el reflujo de la solución, y luego retirar con cuidado el capilar. Ate una sola sutura en el tejido muscular / adiposo superposición de la columna vertebral. Utilice una sutura no interrumpida para cerrar la piel. Aplicar más yodo que el lugar de la incisión. Colocar el animal en una cámara de recuperación calienta hasta que se recupere, y luego volver a su jaula. Aplicar analgésicos post-operativamente según las regulaciones de cuidado de animales institucionales. Por lo general la atención postoperatoria adicional no es necesario ya que los animales son totalmente ambulatorio y capaz de auto-alimentación y la bebida tan pronto como la recuperación de la anestesia. Repita el procedimiento para los demás animales. NOTA: Con el dominio, la operación se puede completar en 10-15 min por animal, en particular con la ayuda de una segunda persona atar las suturas. Lo mismo capilar de vidrio se puede utilizar durante aproximadamente 15 a 20 cirugías antes del consejo pierde filo y debe ser reemplazado. Cirugías de control pueden ser realizadas de forma idéntica como se describe, con una inyección de PBS en la médula espinal en lugar de lisolecitina. No se recomienda la limpieza de los capilares para su uso futuro. 4. Procesamiento de tejido y análisis Sacrificio de los animales con una sobredosis intraperitoneal de ketamina (500 mg / kg) y xilazina (25 mg / kg) en los puntos de tiempo deseados. Las lesiones generalmente evolucionan en el follmanera debido: 1-3 días, desmielinización activa; 3-7 días, el reclutamiento OPC; 7-10 días, la diferenciación de oligodendrocitos; 10-21 días, la remielinización activa 2,10,11. Para preparar tejido para histología, primero realizar una perfusión transcardial 12 con 20 ml de PBS RT seguido por 20 ml enfriado en hielo 4% de paraformaldehído en PBS. Para la preparación de resina tejido embebido para la sección semi o ultrafina, consulte el paso 4.9. Retire la médula espinal con unas tijeras de hueso curvadas para cortar a través de cada vértebra comenzando en el extremo cervical de la columna vertebral y de trabajo hasta el nivel torácica inferior. Fijar las médulas espinales O / N en paraformaldehído al 4% en PBS a 4 ° C. Cambiar las cuerdas a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante al menos 72 h. Identificar el sitio de la inyección como una anormalidad en la superficie dorsal de la médula espinal. Corte un pedazo de 3 mm de tejido (con el sitio de la inyección en el centro) y alinear las piezas en criomoldes contienen temperatura óptima de corte (OCT) compound. Suspender la parte inferior de los criomoldes en una mezcla enfriada de 2-metilbutano y hielo seco hasta que el OCT es completamente congelado. Almacenar a -80 ° C hasta el momento de la sección. Sección la médula espinal en un criostato a una anchura de 20 micras en portaobjetos de microscopio y dejar secar al aire O / N antes de guardar las diapositivas a -20 ° C. Detectar localización de la lesión y el tamaño usando un cianina eriocromo mancha histológico de la mielina 13. Realice todos los pasos a TA. Diapositivas con aire seco durante 30 minutos. Colocar los portaobjetos en agente para 1 min seguido de rehidratación en soluciones de etanol graduado (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, agua) de compensación durante 1 min cada uno. Colocar los portaobjetos en eriocromo cianina solución durante 15 min, seguido de un lavado de 1 min con agua. Diferenciar en hidróxido de amonio 0,5% durante 10 s, seguido de un lavado de 1 min con agua. Deshidratar en soluciones graduales de etanol (orden inverso como se describe más arriba) durante 1 minuto cada uno, cubreobjetos con medio de montaje, y la imagen en un campo brillante microscope. Utilice inmunohistoquímica para visualizar los axones y mielina. Diapositivas con aire seco durante 30 minutos. Deshidratar con etanol graduada (agua, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) durante 2 min cada uno a temperatura ambiente, a continuación, invertir el orden de vuelta al agua. Este paso resulta en una mayor resolución de los anillos de mielina individuales 14. Bloquear interacciones no específicas de anticuerpos utilizando 10% de suero de cabra y 0,25% de Triton X-100 en PBS durante 60 min a TA. Diluir anticuerpos primarios (anti-ratón SMI312 1: 2000, de conejo anti-MBP 1: 1000) en PBS y se incuba en portaobjetos de O / N a 4 ° C. Lavar 5 veces durante 5 min con PBS a RT. Diluir anticuerpos secundarios (Alexa 488 anti-conejo 1: 500, Alexa 546 anti-ratón 1: 500) en PBS e incubar en los portaobjetos durante 60 min a TA. Lavar 5 veces durante 5 min con PBS a RT. Monte desliza con cubreobjetos utilizando gelvatol e imagen en un microscopio de fluorescencia. Utilice inmunohistoquímica para visualizar las células del linaje de oligodendrocitos. Siga el procedimiento para step 4.7, omitiendo la etapa de deshidratación / rehidratación, y el uso de 10% de suero de caballo en lugar de suero de cabra. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: cabra anti-PDGFR 1: 100, ratón anti-CC1 1: 200, de conejo anti-Olig2 1: 200. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos secundarios: Alexa 488 anti-cabra 1: 500, Alexa 594 anti-ratón de 1: 500, Alexa 647 anti-conejo de 1: 500. Para preparar el tejido para la sección semi o ultra fino, primero realizar una perfusión transcardial 12 con 20 ml RT PBS seguido de 20 ml helada paraformaldehído al 4% / 1% de glutaraldehído en PBS. Retire la médula espinal, como se describe en el paso 4.3. Fijar O / N en paraformaldehído al 4% / glutaraldehído al 1% en PBS a 4 ° C. Identificar el sitio de inyección como se describe en el paso 4.4. Cortar una pieza de 1 mm de tejido que contiene el sitio de la inyección. Bloques adicionales 1 milímetros a cada lado de la lesión se pueden preparar así si se desea. En una campana de extracción, añadir 10 veces el volumen de 1% de tetróxido de osmio / 1,5% ferrocianuro potásico a cada bloque de hielodurante 60 minutos. NOTA: tetróxido de osmio es una sustancia altamente tóxica y debe manejarse con extremo cuidado. Todos los materiales en contacto con tetróxido de osmio se deben colocar en aceite de maíz (dos veces el volumen como una solución de tetróxido de osmio) para la neutralización. Lavar los cables 3 veces con 0,2 M de cacodilato durante 10 min a RT, descartando en aceite de maíz. Deshidratar con soluciones de etanol graduado (agua, 50%, 70%, 90%, 2 veces con 95%, 2 veces con 100%, 2 veces con óxido de propileno) durante 10 minutos a RT. Cables Insertar en resina como por las instrucciones del fabricante. Cortar los bloques en un ultramicrotomo y montar secciones Onto gotas de agua en el microscopio. Colocar los portaobjetos en una placa caliente (aproximadamente 50 ° C) hasta que se seque. Visualice mielina añadiendo unas gotas de 1% de azul de toluidina solución de bórax / 2% sobre los portaobjetos durante 10-15 segundos a 50 ° C. Enjuague con agua, seca y cubreobjetos con medio de montaje. Secciones de imagen en un microscopio de campo claro.