Expérimental démyélinisation et la remyélinisation de la moelle épinière murin par injection focale de lysolécithine

REMARQUE: Les animaux utilisés dans cette procédure ont été traités conformément avec le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) Lignes directrices. Éthique ont été approuvés par le Comité de l'Université de Calgary le soin des animaux. 1. Préparez la seringue pour injection Dissoudre la lysolécithine à une solution à 1% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) et conserver à -20 ° C en petites aliquotes (75 ul). Décongelez un flacon à température ambiante. REMARQUE: si lysolécithine est non dissous, soniquer le tube dans un nettoyeur à ultrasons (40 kHz) pendant environ 30 minutes pour former une solution uniforme. Manipulez le capillaire en verre pré-tiré avec un soin extrême pour éviter d'endommager la pointe délicate. Dévisser l'écrou d'une seringue injection de 10 pi et le visser sur l'extrémité plate du capillaire suivie par deux embouts, veiller à ce que les extrémités d'accouplement des viroles alignent et le capillaire est bien au chaud dans la virole conique (Figure 1). Rincer la seringue avec isopropalcool yl et retirer le piston. Une fois sec, visser la main d'assemblage de l'aiguille serré sur la seringue d'injection. Fixer l'aiguille de moyeu métallique à la seringue d'amorçage. Pierce un disque de caoutchouc avec l'aiguille et faites-le glisser à la base. Remplir la seringue d'amorçage avec lysolécithine. Enfoncer doucement la seringue d'amorçage jusqu'à ce liquide est visible à la pointe de l'aiguille. Ceci garantit des bulles d'air ne seront pas introduites dans la seringue d'injection. Insérer l'aiguille de moyeu métallique de la seringue d'amorçage dans la seringue d'injection. Faire un joint ferme avec le disque de caoutchouc, appuyez doucement sur la seringue d'amorçage jusqu'à ce que le capillaire remplit à la pointe avec une solution. Retirez délicatement la seringue d'amorçage tout en appuyant simultanément pour remplir le corps de la seringue injecter sans introduire de bulles d'air. Insérer le piston dans la seringue d'injection et d'assurer solution se écoule à partir de la pointe du capillaire lorsque le plongeur est enfoncé doucement. NOTE: Si des bulles d'air sont visibles dans le bouchonIllary injection ou seringue, la préparation de la seringue doit être répété depuis le début. Liquide continu dans le dispositif d'injection est critique pour garantir les volumes d'injection précises. Fixer la seringue injecter rempli au bras d'un micromanipulateur stéréotaxique. Cet appareil rempli sera en mesure d'injecter 15 à 20 animaux avant de devoir être rechargée. Jeter la lysolécithine restant de la seringue d'amorçage. Retirer et appuyer sur l'alcool isopropylique à plusieurs reprises, et de détacher l'aiguille de moyeu métallique. Attendre plusieurs heures pour l'alcool isopropylique restant dans la seringue d'amorçage se évaporer avant de le remplir à nouveau. 2. Préparer des animaux pour les interventions chirurgicales NOTE: Cette procédure est décrite pour les femmes souris C57BL / 6, âgés de 8 à 10 semaines. Anesthésier l'animal avec une injection intrapéritonéale de kétamine (200 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) ou par les règlements de protection des animaux. Plan pour laanimal soit sous anesthésie pendant environ 1 h si vous utilisez l'anesthésie injectable. Test que l'animal est anesthésié profondément en pinçant fermement le pied. Un animal anesthésié ne répondra pas à la pincée. L'aide de tondeuses, de se raser un cm 2 2-3 sur le côté dorsale de l'animal, près des oreilles. Veillez à ne pas endommager les oreilles. Essuyez la zone propre avec 70% d'éthanol appliqué à un tampon de gaze. Assurez-vous que tous les cheveux coupés a été retiré de la zone. Désinfecter la zone avec de l'iode. Appliquez de la vaseline pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant toute la procédure. Gardez l'animal dans une chambre de récupération chauffé jusqu'à ce que prêt à commencer la procédure. 3. Effectuer la procédure chirurgicale REMARQUE: Veiller à une technique aseptique appropriée pour toutes les étapes de la procédure. Cela comprend l'utilisation appropriée de gants, filets à cheveux, des masques et des stores. Tous les outils doivent être stérilisés avant d'entrer en contact avec l'animal. Déplacez l'animal à un cadre stéréotaxique, face dorsale haut, élevé à la section du milieu par des serviettes en papier pliées à exagérer la courbure de la colonne vertébrale. Fixer les bras et la queue avec du ruban adhésif chirurgical et fixer la tête avec un collier de dent. La stabilisation des barres d'oreilles ne sont pas nécessaires pour cette procédure. Utiliser un scalpel pour faire une incision médiane de 3 cm, en commençant juste en dessous des oreilles et de coupe dans la direction caudale. Localisez le fossé entre les deux grandes structures adipeuses et utiliser des pinces fines dans chaque main pour tirer les différencier. Étaler écarteurs pour ouvrir le champ opératoire. Sous un microscope chirurgical, localiser le processus de prolongement important de la vertèbre T2 (Remarque: cette fonction est caractéristique de la souche de souris C57BL / 6). Effectuer un dissection avec des ciseaux à ressort fermé à travers la musculature superposition de mieux visualiser T2. En utilisant les forceps, ressentir pour les surfaces dures de T3 et T4 pour confirmer la localisation anatomique correcte. Avec des ciseaux de printemps, faire des coupes latérales peu profondes (2-3 mm de profondeur) du tissu conjonctif entre T3 et T4. En raison de l'espacement entre les vertèbres naturel dans la partie thoracique supérieure de la colonne vertébrale de la souris, une laminectomie ne est pas nécessaire pour révéler la moelle épinière. Soyez conscient qu'une réduction trop profonde va percer et d'endommager le cordon. REMARQUE: Un petit degré de saignement est commun lors de cette étape. Si cela se produit, maintenez une lance d'éponge dans la région jusqu'à ce que les subventions de la coagulation (30-60 sec). Visualisez la moelle épinière. Il sera recouvert d'une épaisse couche de Dura visible si cette couche méningée ne était pas encore coupé tout en exposant le cordon. Un vaisseau sanguin important exécute caudal / rostrale à travers la ligne médiane approximative de la moelle épinière. NOTE: Ce vasculaire ne doit pas être utilisé comme un point de repère pour la ligne médiane. Au lieu de cela, un éclairage adéquat devrait révéler les limites de la matière grise-blanche flanquant la colonne dorsale, et ceux-ci doit être utilisée pour estimer la ligne médiane. Si la durereste intacte, assurez-éraflures latérales douces avec une aiguille 32 G de métal jusqu'à ce qu'elle soit effacée. Le but est d'enlever la dure-mère tout en ne coupant pas les méninges sous-jacents restants, qui ne sont pas aussi épais et difficiles à voir. REMARQUE: Sortie de liquide céphalo-rachidien indique une violation de l'arachnoïde et tout cela peut se faire sans dommages mécaniques au tissu, le liquide céphalo-rachidien accumulée doit être retiré avec une lance éponge pour mieux visualiser la surface de la corde. Déplacez la seringue injection en place et abaissez lentement jusqu'à ce que la pointe du capillaire touche à peine la moelle épinière immédiatement latérale de chaque côté de la ligne médiane. Verrouiller le bras en place. Utilisez les mesures graduées de bras stéréotaxique direction Z pour effectuer une mesure de position de référence. De cette lecture, il faut soustraire 1,3 mm. Utilisez un mouvement à la baisse rapide et peu profonde pour percer le tissu, puis abaissez délicatement le capillaire jusqu'à ce que la nouvelle mesure est atteint. Facultatif: si vous le souhaitez,lésions de la colonne dorsale peuvent être produites par le même mouvement de perçage sur la ligne médiane et une profondeur de 0,3 mm (voir la discussion pour plus d'informations). NOTE: Ces valeurs sont spécifiques pour injecter entre T3 et T4. Si optant pour effectuer l'injection à tout autre endroit dans la moelle épinière, ces valeurs doivent être tirées de ne importe quel atlas du cerveau de la souris disponibles. Utiliser le micromanipulateur pour enfoncer la lysolécithine dans la substance blanche de la moelle épinière ventrale. Faire une rotation du micromanipulateur toutes les 5 secondes pendant 2 minutes, ce qui entraîne un volume final de 0,5 ul. Laissez le capillaire en place pour 2 min supplémentaires pour empêcher le retour de la solution, puis retirez délicatement le capillaire. Attachez un seul fil de suture dans le tissu musculaire / adipeux recouvrant la colonne vertébrale. Utilisez un fil de suture non-interrompue pour fermer la peau. Appliquer plus d'iode au site d'incision. Placer l'animal dans une chambre de récupération chauffée jusqu'à ce qu'elle se redresse, puis le ramener dans sa cage. Appliquer analgésiques post-fonctionnellement, conformément aux règlements de protection des animaux. Soins post-opératoires supplémentaires est généralement pas nécessaire puisque les animaux sont entièrement ambulatoire et capable d'auto-alimentation et de boire dès qu'ils récupération de l'anesthésie. Répétez la procédure pour les animaux restants. NOTE: Avec la compétence, l'opération peut être achevée en 10-15 minutes par animal, en particulier avec l'aide d'une deuxième personne attachant sutures. La même capillaire en verre peut être utilisé pendant environ 15-20 chirurgies avant la pointe est émoussée et doit être remplacée. chirurgies de contrôle peuvent être effectuées de façon identique comme il est décrit, par une injection de PBS dans la moelle épinière au lieu de la lysolécithine. Nous ne recommandons pas le nettoyage des capillaires pour une utilisation future. 4. Traitement et analyse de tissus Sacrifice des animaux avec une surdose intraperitoneale de kétamine (500 mg / kg) et de xylazine (25 mg / kg) à des moments souhaités. Les lésions évoluent généralement dans le Follde façon raison: 1-3 jours, démyélinisation active; 3-7 jours, le recrutement OPC; 7-10 jours, la différenciation des oligodendrocytes; 10-21 jours, la remyélinisation actif 2,10,11. Pour préparer les tissus pour l'histologie, effectuez d'abord une perfusion transcardial 12 avec 20 ml RT PBS suivis par 20 ml glacée 4% de paraformaldehyde dans PBS. Pour la préparation de la résine tissu enrobé pour la coupe semi ou ultra-mince, voir l'étape 4.9. Retirer la moelle épinière en utilisant des ciseaux courbes d'os pour couper à travers chaque vertèbre à partir de l'extrémité cervicale de la colonne vertébrale et en descendant jusqu'au niveau inférieur thoracique. Fixer les moelles épinières O / N à 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C. Mettez les cordons à 30% de saccharose dans du PBS à 4 ° C pendant au moins 72 heures. Identifier le site d'injection comme une anomalie sur la surface dorsale de la moelle épinière. Coupez un morceau de tissu (avec le site d'injection dans le centre) de 3 mm et d'aligner les morceaux dans cryomoules contenant la température de coupe optimale (OCT) compound. Suspendre la face inférieure des cryomoules dans un mélange refroidi de 2-méthylbutane et de la glace sèche jusqu'à l'OPO est complètement gelé. Stocker à -80 ° C jusqu'au moment de section. Section les cordons de la colonne vertébrale sur un cryostat à une largeur de 20 um sur des lames de microscope et laisser sécher à l'air O / N avant de stocker les diapositives à -20 ° C. Détecter l'emplacement de la lésion et la taille en utilisant un ériochrome cyanine colorant histologique de la myéline 13. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante. diapositives de l'air libre pendant 30 min. Placer les lames dans agent pour 1 min suivis de réhydratation dans les solutions d'éthanol graduées (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, de l'eau) de compensation pour chaque 1 min. Placer les lames dans une solution d'ériochrome cyanine pendant 15 min, suivi d'un lavage de 1 minute avec de l'eau. Différencier dans 0,5% d'hydroxyde d'ammonium pendant 10 s, suivi par un lavage de 1 minute avec de l'eau. Déshydrater dans les solutions d'éthanol graduées (ordre inverse comme décrit ci-dessus) pendant 1 min chacun, lamelle avec les médias de montage, et l'image sur un km champ claircroscope. Utilisez immunohistochimie de visualiser axones et la myéline. diapositives de l'air libre pendant 30 min. Déshydrater l'éthanol gradué (eau, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) pendant 2 min chacun à température ambiante, puis d'inverser l'ordre de retour à l'eau. Cette étape se traduit par une plus grande résolution d'anneaux individuels 14 de la myéline. Bloquer des interactions anticorps non spécifiques en utilisant 10% de sérum de chèvre et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant 60 min à température ambiante. Diluer anticorps primaire (anti-souris SMI312 1: 2000, de lapin anti-MBP 1: 1000) dans du PBS et laisser incuber sur des lames O / N à 4 ° C. Laver 5 fois pendant 5 min avec du PBS à température ambiante. Diluer anticorps secondaire (Alexa 488 anti-lapin 1: 500, Alexa 546 anti-souris 1: 500) dans du PBS et laisser incuber sur des lames pendant 60 min à température ambiante. Laver 5 fois pendant 5 min avec du PBS à température ambiante. Mont coulisse avec des lamelles à l'aide de Gelvatol et image sur un microscope fluorescent. Utilisation immunohistochimie pour visualiser les cellules de la lignée des oligodendrocytes. Suivez la procédure de step 4,7, en omettant l'étape de déshydratation / réhydratation, et en utilisant 10% de sérum de cheval au lieu de sérum de chèvre. Utilisez les dilutions d'anticorps primaires suivants: chèvre anti-PDGFRa 1: 100, de souris anti-CC1 1: 200, de lapin anti-Olig2 1: 200. Utilisez les dilutions d'anticorps secondaires suivants: Alexa 488 anti-chèvre 1: 500, Alexa 594 anti-souris 1: 500, Alexa 647 anti-lapin 1: 500. Pour préparer le tissu pour la coupe semi ou ultra-mince, effectuez d'abord une perfusion transcardial 12 avec 20 ml RT PBS suivi par 20 ml de glace-paraformaldéhyde 4% froid / 1% de glutaraldéhyde dans du PBS. Retirer la moelle épinière comme décrit dans l'étape 4.3. Fixer O / N dans du paraformaldéhyde 4% / 1% de glutaraldéhyde dans du PBS à 4 ° C. Identifier le site d'injection comme décrit dans l'étape 4.4. Couper un morceau de tissu contenant le site d'injection de 1 mm. D'autres blocs de 1 mm de part et d'autre de la lésion peuvent être préparés si on le souhaite ainsi. Dans une hotte, ajouter 10 fois le volume 1% de tétroxyde d'osmium / 1,5% ferrocyanure de potassium pour chaque bloc sur la glacependant 60 min. NOTE: tétroxyde d'osmium est une substance très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême. Tous les matériaux en contact avec le tétroxyde d'osmium doivent être placés dans l'huile de maïs (deux fois de volume comme solution de tétroxyde d'osmium) pour la neutralisation. Laver cordons 3 fois avec 0,2 M de cacodylate pendant 10 min à température ambiante, rejets dans l'huile de maïs. Déshydrater avec des solutions d'éthanol graduées (eau, 50%, 70%, 90%, deux fois avec 95%, deux fois avec 100%, deux fois avec de l'oxyde de propylene) pendant 10 minutes à TA. Cordons Intégrer en résine selon les instructions du fabricant. Couper blocs sur une ultramicrotome et monter les coupes SUR DES gouttelettes d'eau sur des lames de microscope. Placer les lames sur une plaque chaude (environ 50 ° C) jusqu'à ce que sec. Visualisez la myéline en ajoutant quelques gouttes de 1% bleu de toluidine solution de borax / 2% sur les lames pour les 10-15 sec à 50 ° C. Rincer à l'eau, sèche et lamelle avec les médias de montage. sections de l'image sur un microscope à champ clair.