Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

HINWEIS: Die in diesem Verfahren verwendeten Tiere wurden gemäß dem Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien betreut. Ethik wurden von der Animal Care Committee der University of Calgary zugelassen. 1. Bereiten Sie Spritze zur Injektion Löse Lysolecithin auf eine 1% ige Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7.4) aufgenommen und bei -20 ° C in kleinen Aliquots (75 ul). Tauwetter ein Fläschchen auf RT. HINWEIS: Wenn Lysolecithin ungelöst, beschallen das Rohr in einem Ultraschallreiniger (40 kHz) für ungefähr 30 min, um eine einheitliche Lösung zu bilden. Gehen Sie mit dem Pre-gezogen Glaskapillare mit äußerster Vorsicht, um eine Beschädigung der empfindlichen Spitze. Die Mutter einer 10 ul Injektion Spritze abschrauben und ziehen Sie ihn auf den flachen Ende der Kapillare, gefolgt von 2 Aderendhülse, sicherzustellen, dass die passenden Enden der Ferrulen ausrichten und die Kapillare ist gemütlich in der konischen Hülse (Abbildung 1). Spülen Sie die Spritze mit isopropyl Alkohol und nehmen Sie den Kolben. Nach dem Trocknen, schrauben Sie die Nadelanordnung handfest auf die Injektionsspritze. Befestigen Sie die Metallnabe Nadel auf die Grundierung Spritze. Pierce eine Gummischeibe mit der Nadel und schieben Sie sie bis auf den Grund. Füllen Sie die Spritze mit Grundierung Lysolecithin. Der Entlüftungs Spritze leicht drücken bis Flüssigkeit an der Spitze der Nadel sichtbar wird. Dies stellt sicher, Luftblasen nicht in die Injektionsspritze eingeführt werden. Legen Sie die Metall-Hub Nadel der Spritze in die Grundierung Injektionsspritze. Einen festen Dichtung mit der Gummischeibe, langsam die Grundierung Spritze drücken, bis die Kapillare füllt bis zur Spitze mit Lösung. Entfernen Sie vorsichtig die Grundierung Spritze und gleichzeitig gedrückt, um den Lauf der Injektionsspritze, ohne dabei Luftblasen zu füllen. Legen Sie den Kolben in die Injektionsspritze und sicherzustellen Lösung fließt von der Spitze der Kapillare, wenn der Kolben sanft gedrückt wird. HINWEIS: Wenn Luftblasen in der Kappe zu sehen sindIllary oder Injektionsspritze, muss die Spritze Herstellung von Anfang an wiederholt werden. Kontinuierliche Fluid in der Einspritzvorrichtung ist kritisch, um genaue Injektionsvolumina sicherzustellen. Das ausgefüllte Injektionsspritze auf dem Arm eines stereotaktischen Mikromanipulator. Dies vervollständigte Vorrichtung in der Lage, 15-20 Tiere benötigen, bevor neu befüllt werden injizieren. Entsorgen Sie die Rest Lysolecithin aus der Grundierung Spritze. Zurückziehen und mehrmals drücken Isopropylalkohol, und nehmen Sie den Metallnabe Nadel. Warten Sie einige Stunden für den Rest Isopropyl-Alkohol in der Grundierung Spritze vor dem erneuten Befüllen verdampfen. 2. Bereiten Tier für Operationsverfahren Hinweis: Dieses Verfahren ist für die weibliche C57BL / 6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen beschrieben. Betäuben des Tieres mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (200 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) oder pro Institutional Animal Care Vorschriften. Plan für dieTier unter Narkose für ca. 1 Stunde, wenn mit injizierbaren Anästhesie. Testen Sie, ob das Tier tief durch festes Einklemmen des Fußes betäubt. Ein richtig anästhesiert Tier nicht auf die Pinch reagieren. Mit Knipser, rasieren eine 2-3 cm 2 Fläche auf der Rückenseite des Tieres, in der Nähe der Ohren. Achten Sie darauf, das Gehör beschädigen. Wischen Sie den Bereich mit 70% Ethanol auf eine Gaze aufgebracht. Stellen Sie sicher, alles abgeschnitten Haare aus dem Bereich entfernt wurde. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod. Vaseline in die Augen, um das Trocknen während des Verfahrens zu verhindern. Halten Sie das Tier in einem beheizten Rückgewinnungskammer bis bereit, das Verfahren zu beginnen. 3. Führen Sie die Operationsverfahren HINWEIS: Für angemessene aseptische Technik für alle Schritte des Verfahrens. Dazu gehören die ordnungsgemäße Verwendung von Handschuhen, Haarnetze, Masken und Vorhänge. Alle Werkzeuge sollten, bevor er in contac sterilisiert werdent mit dem Tier. Bewegen Sie das Tier an einen stereotaktischen Rahmen, bis Rückenseite, erhöht in der Mitte Abschnitt von gefalteten Papierhandtücher, um die Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben. Befestigen Sie die Arme und Schwanz mit chirurgischen Band und sichern Sie den Kopf mit einer Zahnklammer. Stabilisierende Ohr Bars sind nicht notwendig für dieses Verfahren. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 3 cm Mittelschnitt zu machen, beginnend direkt unter den Ohren und Schneiden in der kaudal. Suchen Sie die Kluft zwischen den 2 großen adipösen Strukturen und benutzen feinen Pinzette in jeder Hand, um diese auseinander zu ziehen. Verbreiten Sie Retraktoren auf das Operationsfeld zu öffnen. Unter einem Operationsmikroskop, suchen Sie die prominente Auswuchs Prozess des T2 Wirbel (Hinweis: Diese Funktion ist charakteristisch für den C57BL / 6-Maus-Stamm). Führen Sie eine stumpfe Dissektion mit geschlossener Frühjahr Schere durch die Überlagerung der Muskulatur, um besser zu visualisieren T2. Mit der Pinzette, fühlen für den harten Oberflächen von T3 und T4 die richtige anatomische Lage zu bestätigen. Mit Federschere, machen flache seitliche Schnitte (2-3 mm tief) des Bindegewebes zwischen T3 und T4. Aufgrund der natürlichen Abstand zwischen den Wirbeln in der oberen Brustabschnitt der Maus Wirbelsäule ist eine Laminektomie nicht notwendig, offenbaren das Rückenmark. Denken Sie, dass zu tief ein Schnitt wird durchstoßen und beschädigen Sie das Kabel. HINWEIS: Ein kleiner Grad der Blutung ist bei diesem Schritt gemeinsam. Wenn dies geschieht, halten Sie einen Schwamm Speer in den Bereich, bis die Blutungen Subventionen (30-60 s). Visualisieren Sie das Rückenmark. Es wird mit einer dicken Schicht aus sichtbar Dura abgedeckt werden, wenn diese Hirnhautschicht wurde noch nicht geschnitten, gleichzeitig jedoch das Kabel. Ein prominenter Blutgefäß läuft Schwanz / rostral durch die ungefähre Mittellinie des Rückenmarks. HINWEIS: Diese Gefäßsystem sollte nicht als ein Wahrzeichen für die Mittellinie verwendet werden. Stattdessen sollte eine ausreichende Beleuchtung der grau-weiße Angelegenheit Grenzen flankieren den dorsalen Säule zu offenbaren, und diese sollten verwendet werden, um die Mittellinie zu schätzen. Wenn der Durableibt erhalten, stellen sanfte seitliche Schrammen mit einer 32 G Metallnadel, bis es gelöscht wird. Ziel ist es, die Dura zu entfernen, während nicht schneiden Sie die verbleibenden zugrunde liegenden Hirnhäute, die nicht so dick und schwerer zu finden sind. HINWEIS: Freisetzung von Liquor eine Verletzung der Arachnoidea und während dies ohne mechanische Schädigung des Gewebes auftreten, sollte die akkumulierte Cerebrospinalflüssigkeit mit einem Schwamm Lanze entfernt, um die Oberfläche des schnur besser sichtbar werden. Bewegen Sie die Injektionsspritze an Ort und Stelle und langsam absenken, bis die Spitze der Kapillare gerade noch berührt das Rückenmark sofort seitlichen von beiden Seiten der Mittellinie. Verriegeln Sie den Arm in Position. Verwenden Sie die abgestufte Messungen der Z-Richtung der stereotaktischen Arm um eine Grundlinie Positionsmessung zu machen. Von diesem Messwert, subtrahieren 1,3 mm. Verwenden Sie eine schnelle und flache Abwärtsbewegung, um das Gewebe zu durchdringen und dann lassen Sie das kapillare, bis die neue Messung erreicht ist. Optional: wenn gewünscht,Läsionen in der dorsalen Säule kann durch das gleiche Stechbewegung an der Mittellinie und einer Tiefe von 0,3 mm (siehe Diskussion für weitere Informationen) erzeugt werden. ANMERKUNG: Diese Werte spezifisch für Injektion zwischen T3 und T4. Wenn die Entscheidung, um die Injektion an irgendeiner anderen Stelle in der Wirbelsäule durchzuführen, müssen diese Werte von allen verfügbaren Mausgehirnatlas abgeleitet werden. Verwenden Sie die Mikromanipulator in der ventralen Rückenmark weißen Substanz drücken Lysolecithin. Make 1 Drehung der Mikromanipulator alle 5 Sekunden 2 Minuten, was zu einem Endvolumen von 0,5 & mgr; l. Verlassen Sie die Kapillare in Platz für 2 weitere Minuten, um Rückfluss von Lösung zu verhindern, und dann vorsichtig die Kapillare. Binden Sie einen einzigen Faden in der Überlagerung der Wirbelsäule Muskel / Fettgewebe. Verwenden Sie eine nicht-Knopfnaht, um die Haut zu schließen. Anwenden mehr Jod Inzisionsstelle. Legen Sie das Tier in einem beheizten Rückgewinnungskammer, bis sie wieder, dann wieder in seinem Käfig. Bewerben Analgetika post-operativ nach institutionellen Tierpflegevorschriften. Zusätzliche postoperative Pflege ist in der Regel nicht erforderlich, da die Tiere uneingeschränkt gehfähig und in der Lage, selbst Fress- und Trink, sobald sie aus der Narkose. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Tiere. HINWEIS: Mit Kompetenz, der Betrieb kann in 10-15 Minuten pro Tier vor allem mit Hilfe einer zweiten Person zu binden Nähten abgeschlossen sein. Das gleiche Glaskapillare können für ca. 15-20 Operationen verwendet werden, bevor die Spitze stumpf und muss ersetzt werden. Steueroperationen können identisch ausgeführt werden, wie beschrieben, mit einer Injektion von PBS in das Rückenmark statt Lysolecithin. Wir empfehlen nicht, die Reinigung der Kapillaren für die zukünftige Verwendung. 4. Die Gewebeverarbeitung und -analyse Opfern die Tiere mit einer intraperitonealen Dosis von Ketamin (500 mg / kg) und Xylazin (25 mg / kg) in gewünschten Zeitpunkten. Läsionen in der foll entwickeln typischerweiseaufgrund Weise: 1-3 Tage, aktive Demyelinisierung; 3-7 Tage, OPC-Einstellung; 7-10 Tage, Oligodendrozyten-Differenzierung; 10-21 Tage, aktiv Remyelinisierung 2,10,11. Um Gewebe für die Histologie vorbereitet, zunächst eine transkardialer Perfusion 12 führen mit 20 ml RT PBS, gefolgt von 20 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Für die Herstellung von Harz eingebetteten Gewebe für halb- oder ultradünne Schnitte, siehe Schritt 4.9. Entfernen Sie das Rückenmark mit gebogenen Knochen Schere, um durch die einzelnen Wirbel ab zervikalen Ende der Wirbelsäule und Arbeiten bis in den unteren Brust Ebene geschnitten. Fixieren die Rückenmark O / N in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C. Schalten Sie die Kabel auf 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C für mindestens 72 Stunden. Identifizieren der Injektionsstelle nach einer Anomalie auf der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks. Schneiden Sie ein 3 mm Gewebestück (mit der Injektionsstelle in der Mitte) und in cryomolds, die optimale Schnitttemperatur (OAT) co richten Sie die Stückempound. Hängen Sie die Unterseite der cryomolds in einem gekühlten Mischung aus 2-Methyl und Trockeneis, bis der Oktober vollständig gefroren ist. Bei -80 ° C bis zu seiner Sektion. Abschnitt der Rückenmark auf einem Kryostaten bei einer Breite von 20 & mgr; m auf Objektträgern und an der Luft trocknen O / N vor dem Speichern der Objektträger bei -20 ° C. Detect Läsion Lage und Größe mit einem Eriochrom Cyanin histologische Fleck von Myelin 13. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Luft trocknen Folien für 30 min. Die Objektträger in Klärmittel für 1 min, gefolgt von Rehydratisierung in abgestuften Ethanollösungen (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, Wasser) für jeweils 1 min. Die Objektträger in Eriochrome Cyanin-Lösung für 15 min, gefolgt von einer 1 min mit Wasser gewaschen. Differenzieren in 0,5% Ammoniumhydroxid für 10 sec, gefolgt von einer 1 min mit Wasser gewaschen. Entwässern in abgestuften Ethanollösungen (in umgekehrter Reihenfolge wie oben beschrieben) für 1 min jeweils, Deckglas mit Montage Medien und Bild auf einer Hellfeld-mikop. Verwenden Sie die Immunhistochemie auf Axone und Myelin zu visualisieren. Luft trocknen Folien für 30 min. Entwässern mit abgestuften Ethanol (Wasser, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) für jede 2 Minuten bei Raumtemperatur und dann in umgekehrter Reihenfolge wieder zu Wasser. Dieser Schritt führt zu einer höheren Auflösung der einzelnen Ringe 14 Myelin. Blockieren nicht-spezifischer Antikörper-Wechselwirkungen unter Verwendung von 10% Ziegenserum und 0,25% Triton X-100 in PBS für 60 min bei RT. Verdünnte primäre Antikörper (Maus-anti-SMI312 1: 2.000 Kaninchen-Anti-MBP 1: 1000) in PBS und Inkubation auf Folien O / N bei 4 ° C. Für 5 min mit PBS bei RT Waschen 5mal. Verdünnte sekundäre Antikörper (Alexa 488-Anti-Kaninchen 1: 500, Alexa 546-Anti-Maus 1: 500) in PBS und Inkubation auf Objektträgern für 60 min bei RT. Für 5 min mit PBS bei RT Waschen 5mal. Halterung gleitet mit Deckgläschen mit Gelvatol und Bild auf einem Fluoreszenzmikroskop. Immunhistochemie an Zellen des Oligodendrozyten-Linie sichtbar. Befolgen Sie die Anweisungen für step 4,7 Weglassen der Dehydratisierung / Rehydratisierung Schritt und unter Verwendung von 10% Pferdeserum anstelle von Ziegenserum. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper Verdünnungen: Ziege-Anti-PDGFRα 1: 100, Maus-Anti-A1 1: 200, Kaninchen-Anti-Olig2 1: 200. Verwenden Sie die folgenden sekundären Antikörperverdünnungen: Alexa 488 Anti-Ziege 1: 500, Alexa 594-Anti-Maus 1: 500, Alexa 647-Anti-Kaninchen 1: 500. Um Gewebe für halb- oder ultradünne Schnitte vorzubereiten, zuerst eine transkardialer Perfusion 12 führen mit 20 ml RT PBS, gefolgt von 20 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd / 1% Glutaraldehyd in PBS. Entfernen des Rückenmarks, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Fix O / N in 4% Paraformaldehyd / 1% Glutaraldehyd in PBS bei 4 ° C. Identifizieren Sie die Injektionsstelle, wie in Schritt 4.4 beschrieben. Schneiden Sie ein 1 mm Stück mit dem Gewebe der Injektionsstelle. Zusätzlich 1 mm Blöcke auf jeder Seite der Läsion, wenn gewünscht, hergestellt werden, sowie. In einer Abzugshaube, fügen Sie das 10-fache Volumen 1% Osmiumtetroxid / 1,5% Kaliumferrocyanid auf jeden Block auf dem Eisfür 60 min. HINWEIS: Osmiumtetroxid ist eine hochgiftige Substanz, und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Alle Materialien, die in Kontakt mit Osmiumtetroxid sollte in Maisöl (das doppelte Volumen wie Osmiumtetroxid-Lösung) zur Neutralisation platziert werden. Waschen Korden 3 mal mit 0,2 M Cacodylat 10 min bei RT, Verwerfen in Maisöl. Entwässern mit abgestuften Ethanollösungen (Wasser, 50%, 70%, 90%, 2-mal mit 95%, 2-mal mit 100% 2-mal mit Propylenoxid) für 10 Minuten bei RT. Betten Sie Kabel in Harz nach Herstellerangaben. Schneiden Blöcke auf einem Ultramikrotom und montieren Schnitte auf Wassertropfen auf Objektträgern. Objektträger auf eine heiße Platte (ca. 50 ° C) bis zur Trockne. Visualisieren Myelin durch Zugabe einiger Tropfen von 1% Toluidinblau / 2% Borax-Lösung auf die Objektträger für 10-15 sec bei 50 ° C. Mit Wasser abspülen, trocken und Deckglas mit Montage Medien. Bildausschnitte auf einem Hellfeld-Mikroskop.