リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

注：この手順で使用する動物は動物管理上のカナダ人評議会（CCAC）のガイドラインに従って世話た。倫理はカルガリー大学の動物ケア委員会によって承認された。 1.注射用シリンジを準備少量のアリコート（75μL）で-20℃で、店舗; 1％のリン酸緩衝生理食塩水で液（pH7.4 PBS）にリゾレシチン溶かす。 RTにバイアルを解凍する。 NOTE：リゾレシチンが未溶解であれば、均一な溶液を形成し、約30分間超音波洗浄機（40 kHz）のチューブを超音波処理する。 繊細な先端部を損傷しないように細心の注意を払って、事前に引っ張らガラスキャピラリーを処理します。 10μlの注入シリンジのナットを緩めてフェルールの嵌合端が整列し、毛細血管が円錐形のフェルール（ 図1）でジャストサイズであることを確認、2フェルールに続く毛細血管の平坦な端にそれを通します。 isopropで注射器をすすぐイルアルコール及びプランジャーを取り外します。乾燥したら、注入注射器の上にタイトな針アセンブリの手をねじ込みます。 プライミングシリンジに金属ハブ針を取り付けます。ピアース針でゴムディスクとベースにそれを下にスライドさせます。リゾレシチンでプライミング注射器を埋める。液体は、針の先端に表示されるまで、静かにプライミング注射器を押し下げる。これは気泡が注入注射器に導入されることはありませんが保証されます。 注入シリンジにプライミング注射器の金属ハブ針を挿入します。毛細血管が液で先端にいっぱいになるまでゴムディスクとしっかりシールを作り、ゆっくりプライミングシリンジを押し下げる。同時に気泡を導入することなく、注入シリンジのバレルを埋めるために押しながら慎重にプライミング注射器を取り外します。注入シリンジにプランジャーを挿入し、プランジャが優しく押されたようなソリューションは、キャピラリの先端から流れを確認してください。 注意：気泡がキャップに表示された場合illaryまたは注射器を注入し、注射器の準備を最初から繰り返す必要があります。注入装置内の連続流体は、正確な注入量を確保することが重要です。 定位マイクロマニピュレータのアームに完成した注入シリンジを取り付けます。この完成した装置が再充填される必要の前に15〜20の動物を注入することができます。 プライミングシリンジから残りのリゾレシチンを捨てる。撤回し、イソプロピルアルコールを数回押すと、金属ハブ針を取り外す。再び充填する前に蒸発させるためにプライミング注射器の残りのイソプロピルアルコールのために数時間待ちます。 2.手術手順のために動物を準備注：この手順は、雌のC57BL / 6マウスについて記載した8〜10週齢ている。 ケタミン（200ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）のまたは施設動物ケア規制あたり腹腔内注射で動物を麻酔する。計画する注射用麻酔を使用している場合で約1時間、麻酔下にある動物。 動物が深くしっかりと足をつまんで麻酔をしていることをテストします。適切に麻酔した動物は、ピンチに応答しません。 バリカンを使用して、耳に近い動物の背側2-3 cm 2の面積を、剃る。耳を傷つけないように注意してください。 ガーゼパッドに適用される70％のエタノールできれいな部分を拭いてください。すべてのクリップされた髪はエリアから削除されていることを確認してください。ヨウ素とエリアを消毒する。 作業中は乾燥を防ぐために、目にワセリンを適用します。 手順を開始する準備ができるまで加熱された回収室で動物を保​​管してください。 3.手術手順を実行します注：手順のすべてのステップのための適切な無菌操作を確認してください。これは手袋、hairnets、マスク、ドレープの適切な使用が含まれています。すべてのツールはコンタックに来る前に滅菌する必要があります動物とトン。 定位フレーム、背側までに動物を移動し、背骨の湾曲を誇張するために折り畳まれた紙タオルによって中間部分に上昇。外科テープで腕や尾を固定し、歯クランプで頭部を固定します。安定耳のバーは、この手順のために必要ではない。 ちょうど耳の下に開始し、尾側方向に切断、3cmの正中切開を作るためにメスを使用してください。 2つの大きな脂肪構造間の格差を見つけて、これらを引き離すために、それぞれの手で細かい鉗子を使用しています。手術野を開くには、リトラクターを広げた。 手術用顕微鏡下では、T2の椎骨の顕著な成長過程を見つけ（注：この機能は、C57BL / 6マウス系統の特徴である）。よりよいT2を可視化するためにオーバーレイ筋肉組織を通じて、閉じた春のハサミで鈍的切開を行います。鉗子を使用して、適切な解剖学的位置を確認するために、T3、T4の硬い表面のために感じる。 春のはさみを使用して、T3とT4の間の結合組織の（2〜3ミリメートルの深さ）浅い横カットを行う。によるマウス脊柱の上部胸部椎骨間の自然の間隔に、椎弓切除術は、脊髄を明らかにする必要はない。深すぎるカットはコードを貫通し、損傷していることに留意してください。 注：出血の小さな程度は、このステップの間が一般的です。この問題が発生した場合、出血治まっ（30〜60秒）までの領域にスポンジ槍を開催しています。 脊髄を視覚化。コー​​ドを露出させ、この髄膜層がまだカットされなかった場合、それは目に見える硬膜の厚い層で覆われます。著名な血管が脊髄のおおよその正中線を通して尾/吻側を実行します。 注：この血管系は、正中線のためのランドマークとして使用すべきではありません。代わりに、適切な照明が脊柱に隣接するグレー白質の境界を明らかにする必要があり、これらは正中線を推定するために使用されるべきである。 硬膜の場合それがクリアされるまでそのまま残り、32のG金属針で穏やかな横方向の擦り傷を作る。目標は、厚いと見ることが困難ではない残りの根本的な髄膜をカットしないが、硬膜を除去することである。 注：脳脊髄液の放出は、くも膜の違反を示し、これは、組織への機械的な損傷を与えることなく発生する可能性がありながら、蓄積された脳脊髄液は、より良いコードの表面を可視化するためにスポンジ槍で削除する必要があります。 所定の位置に注入する注射器を移動し、キャピラリの先端がかろうじて正中線の両側の直ぐ横の脊髄に触れるまでゆっくりとそれを下げる。所定の位置に腕をロックします。 ベースライン位置測定を行うために、Z方向定位アームの段階的な測定値を使用してください。この読みから、1.3ミリメートルを引く。組織を貫通するの迅速かつ浅い下向きの運動を使用し、新しい測定に到達するまで、慎重にキャピラリーを下げる。オプション：必要に応じて、背側の列の病変は正中線で同じ突き刺し運動と0.3ミリメートル（詳細については、議論を参照）の深さで製造することができる。 注：これらの値は、T3とT4の間で注入するための固有のものです。脊髄内の他の場所で噴射を行うことを選択した場合、これらの値は、任意の利用可能なマウス脳アトラスから導出されなければならない。 腹側脊髄白質にリゾレシチン押し下げマイクロマニピュレーターを使用してください。 0.5μlの最終容量で、その結果、2分間マイクロマニピュレータの1回転ごとに5秒を行います。ソリューションの逆流を防止するために、2つの追加分の場所に毛細血管のままにしてから、慎重に毛細血管を削除します。 脊柱を重ね筋肉/脂肪組織内の単一の縫合糸を結ぶ。皮膚を閉じるには、非中断された縫合糸を使用してください。切開部位へのより多くのヨウ素を適用します。 それが回復するまで、そのケージに戻した後、加熱された回収室で動物を置きます。鎮痛薬の適用後動作的制度的動物管理規則に従って。動物が完全に歩行可能と自己摂食とすぐ麻酔からの彼らの回復として飲むことのできるように追加の術後ケアは通常は必要ありません。 残りの動物のための手順を繰り返します。 注：習熟すると、操作は特に縫合糸を結ぶ第二の人の助けを借りて、動物あたり10〜15分で完了することができます。先端が鈍いとなり、交換しなければならない前に、同一のガラスキャピラリーは、約15-20手術のために使用することができる。代わりに、リゾレシチンの脊髄にPBSを注射して、説明したように制御手術は同一に行うことができる。私たちは、将来の使用のために毛細血管のクリーニングはお勧めしません。 4.組織の処理と解析所望の時点で、ケタミン（500 mg / kgを）およびキシラジン（25mg / kgの）の腹腔内過剰摂取で動物を生け贄に捧げる。病変は通常、follで進化による方法：1-3日、アクティブな脱髄。 3-7日、OPCの募集。 7-10日、オリゴデンドロサイト分化。 10-21日、アクティブな再ミエリン2,10,11。 最初のPBS中の20 mlの氷冷4％パラホルムアルデヒド、続いて20ミリリットルRT PBSを経心灌流12を実行し、組織学のために組織を調製した。半または超薄切片用樹脂包埋組織の調製のために、ステップ4.9を参照してください。 各脊椎、脊柱の頸部の終わりで始まり、下位胸椎レベルまで作業を切断するように湾曲した骨のはさみを使用して脊髄を削除します。 4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で脊髄O / Nを修正。少なくとも72時間、4℃でPBS中30％のショ糖にコードを切り替えます。 脊髄の背側表面上の異常として注射部位を同定する。 （中央の注射部位との）組織の3ミリメートルピースをカットし、最適な切削温度（OCT）Coを含むcryomoldsにピースを揃えるmpound。 10月には完全に凍結するまで2-メチルブタンとドライアイスの冷蔵混合物中のcryomoldsの下側を一時停止します。セクションの準備ができるまで-80℃で保管してください。 顕微鏡スライド上に20μmの幅でセクションクライオスタット上で脊髄を、空気乾燥Oに許可/ N、-20℃でスライドを格納する前に。 ミエリン13のエリオクロムシアニン組織学的染色を用いて病変の位置およびサイズを検出する。 RTですべての手順を実行します。 30分間空気乾燥スライド。 1分間ずつ段階的エタノール溶液中で再水和に続いて1分（100％、95％、90％、70％、50％、水）のためのクリアリング剤の代わりにスライドする。 水で1分間洗浄した15分間のエリオクロムシアニン溶液中でスライド、。水で1分間洗浄し、続いて10秒間、0.5％水酸化アンモニウム中で分化する。明視野マイルで1分間取り付けメディアそれぞれ、カバースリップ、および画像のため（上記のように順序を逆に）段階的なエタノール溶液中で脱水するcroscope。 軸索とミエリンを可視化するために免疫組織化学を使用してください。 30分間空気乾燥スライド。 RTで2分間ごとに、段階的なエタノール（水中、50％、70％、90％、95％、100％）で脱水し、再び水に順序を逆にする。このステップでは、個々のミエリンリング14のより高い解像度になる。 RTで60分間、PBS中10％ヤギ血清と0.25％のトリトンX-100を使用して、非特異的抗体相互作用をブロックする。一次抗体（：2000、ウサギ抗MBP 1：マウス抗SMI312 1千）で希釈し、PBS中にし、O / N 4℃でスライド上でインキュベートする。 室温でPBSで5分間5回洗浄する。 PBS中、室温で60分間スライド上でインキュベートした二次抗体（500：500、アレクサ546抗マウス1のAlexa 488抗ウサギ1）で希釈する。室温でPBSで5分間5回洗浄する。マウントは、蛍光顕微鏡でgelvatolとイメージを使用して、カバーガラスと摺動する。 オリゴデンドロサイト系統の細胞を可視化するために免疫組織化学を使用してください。 STの手順に従ってくださいディスコグラフィ4.7、脱水/再水和工程を省略し、10％ウマ血清の代わりにヤギ血清を用いて。ヤギ抗PDGFRα1：100、マウス抗CC1 1：200、ウサギ抗OLIG2 1：200以下の一次抗体希釈液を使用してください。アレクサ488抗ヤギ1：500、アレクサ594抗マウス1：500、アレクサ647抗ウサギ1：500以下の二次抗体の希釈液を使用してください。 半または超薄切片用組織を調製するために、第腔的潅流を行い、12mlの 20 RT PBSをPBS中の20 mlの氷冷4％パラホルムアルデヒド/ 1％グルタルアルデヒドが続く。ステップ4.3で説明したように、脊髄を除去します。 4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド/ 1％グルタルアルデヒドでO / Nを修正。 ステップ4.4で説明したように注射部位を特定します。注射部位を含む組織の1ミリメートルの部分をカット。必要に応じて病変のいずれかの側に追加の1mmのブロックは、同様に調製することができる。 ドラフト内で、氷上で各ブロックに10倍量の1％四酸化オスミウム/ 1.5％フェロシアン化カリウムを加える60分間。 注：四酸化オスミウムは、毒性の高い物質であり、細心の注意を払って取り扱ってください。四酸化オスミウムと接触する全ての材料は、中和のためにコーン油（四酸化オスミウム溶液の倍容量）中に配置されるべきである。 コー​​ン油に廃棄、室温で10分間、0.2Mカコジルでコードを3回洗浄する。段階的エタノール溶液（水中、50％、70％、90％、95％で2回、100％で2回、プロピレンオキシドと2回）、室温で10分間で脱水する。 製造元の指示に従って樹脂に埋め込むコード。 ウルトラ上のブロックをカットし、顕微鏡スライド上の水滴の上のセクションをマウントします。乾燥するまでホットプレート（約50℃）の上に置いてスライドする。 50℃で10〜15秒間、スライド上の1％トルイジンブルー/ 2％のホウ砂溶液を数滴添加することにより、ミエリンを可視化する。マウントメディアと水、ドライ、そしてカバースリップですすいでください。明視野顕微鏡での画像セクション。