Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בהיווצרות רובד המכילה oligodendrocytes איבדה, מיאלין, האקסונים, ותאי עצב. חידוש יצירת המיאלין הוא מנגנון תיקון אנדוגני לפי המיאלין החדש מיוצר לאחר התפשטות, גיוס, והתמיינות של תאי מבשר oligodendrocyte לoligodendrocytes יוצרי מיאלין, ויש צורך להגן על האקסונים מנזק נוסף. נכון לעכשיו, כל התרופה לטיפול בטרשת הנפוצה למקד את הרכיב החריג חיסוני של המחלה, אשר להפחית התקפים דלקתיים אבל לא למנוע התקדמות לירידת נוירולוגית בלתי הפיכה. לכן זה הכרחי כי אסטרטגיות קידום חידוש יצירת המיאלין מפותחות אשר עשוי לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. מודלים של בעלי חיים כמה מdemyelination קיימים, כוללים Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני וcurprizone; עם זאת, יש Limitations בשימוש בם ללימוד חידוש יצירת המיאלין. גישה חזקה יותר היא הזרקת המוקד של רעלים במערכת העצבים המרכזית, כוללים lysolecithin חומר הניקוי לתוך החומר לבן חוט השדרה של מכרסמים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההליך הכירורגי הכרוך בהזרקת lysolecithin לחומר לבן הגחון של עכברים הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ולא דורש חומרים נוספים מאלה זמינים מסחריים. הליך זה הוא חשוב לא רק ללימוד האירועים הרגילים מעורבים בתהליך יצירת מיאלין מחדש, אלא גם ככלי פרה-קליני לסינון תרופות קידום חידוש יצירת המיאלין מועמד.
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה כרונית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירת תאים חיסונית ושלטים המכילים איבדו המיאלין, oligodendrocytes, אקסונים ותאי עצב. רוב החולים מהלך מחלה מורכב מהתקפים דלקתיים מלווים במגוון רחב של תסמינים נוירולוגיים, ואחריו תקופות של הפוגה. למעלה ממחצית חולים אלו סופו של דבר לעבור לשלב מתקדם משניים ללא הישנות לכאורה אך ירידת נוירולוגית מתמשכת. הוא האמין כי ההידרדרות מתקדמת וזאת בשל נזק ואובדן axonal, תרם בחלקו על ידי demyelination הכרוני. אסטרטגיות כדי לשחזר מיאלין שאבד הם וכך נחשבים גישת טיפול מבטיחה לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים.
חידוש יצירת המיאלין היא תגובת תיקון אנדוגני במערכת העצבים המרכזית לפיה נדני המיאלין חדשים שנוצרו מתאי מבשר oligodendrocyte גויסו(OPCs) שלהתמיין oligodendrocytes יוצרי מיאלין. חידוש יצירת המיאלין הוכח במודלים של בעלי חיים כדי להיות די חזק 1-3, לעומת זאת, היעילות שלה יורדת עם גיל 4. ואכן, חידוש יצירת המיאלין מתרחשת בבני אדם למרות שהוא לא שלם ברוב המכריע של חולי טרשת נפוצה 5. כל התרופות זמינות כעת עבור MS בעיקר למקד את הרכיב חיסוני החריג של המחלה, ובעוד יעילים בהפחתת התקפים, לא במידה ניכרת לעכב את התקדמות מחלה. הדור הבא של אסטרטגיות טיפוליות לניהול MS ישלב התקדמות בתפקוד מערכת חיסון עם השיפור של חידוש יצירת המיאלין אנדוגני כדי למנוע הישנויות שני והתקדמות 6.
שיטה אחת ללמוד דה וחידוש יצירת המיאלין במערכת העצבים המרכזית כרוכה בהזרקה הישירה של חומר הניקוי lysophosphatidylcholine (lysolecithin) ל1,3,7 חומר לבן בחוט השדרה. הליך זה מייצר demyelinat מאופיין היטבing פציעה מורכב בעיקר של מקרופאג / חדירת microglial והפעלה 8,9, astrogliosis תגובתי, ההפרעות של הומאוסטזיס axonal / פציעת axonal, והתפשטות OPC והגירה 10. הנגע צפוי מתפתח על פני תקופה של כמה שבועות, והוא מסוגל באופן מלא remyelinating סופו של דבר. שיטה זו הייתה שימושית במיוחד בלימוד כוריאוגרפיה של אירועים המעורבים בדה וחידוש יצירת המיאלין. יתר על כן, זה כבר אימץ ככלי לבדיקות פרה-קליניות של טיפולי מועמד להאצת תיקון הבאים עלבון demyelinating.
מספר המודלים של בעלי החיים פותחו ללמוד MS, רוב recognizably המודל הניסיוני Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE). בEAE, מכרסמים הם חוסנו נגד שבר של פפטיד המיאלין ועוברים התפתחות נגע דלקתית המתבטאת בשיתוק עולה. בעוד מודל זה היה שימושי עבור בדיקות פרה-קליניות של תרופות טרשת נפוצה המערכת החיסונית, זה לא אידיאלי ללימוד חידוש יצירת המיאלין משלוש סיבות עיקריות: ראשית, המיקום של נגעים דלקתיים הוא אקראי במידה מסוימת, ואיתור נגעים בעת עיבוד רקמות ללמחצה או ultrathin חלקים יכולים להיות מאתגרים. השני הוא שחידוש יצירת המיאלין מתרחש על פני כמובן זמן מסוים, והגיל של נגע EAE אחת המדויק לא ניתן לדעת בלי הדמיה מגנטית לא פולשנית מתמשכת תהודה. השלישי הוא שחידוש יצירת המיאלין הוא תופעה מתרחשת באופן טבעי במכרסמים, וראיה לחידוש יצירת המיאלין הבאה טיפול תרופתי בEAE לא יכולה להיות תוצאה העיקרית של התרופה, אבל בסטיד תופעה משנית של הפחתת דלקת.
שיטה נפוצה נוספת של ייצור demyelination מושגת על ידי החדרת cuprizone chelator הנחושת בתזונה. כתוצאה מכך demyelination הנרחב, בעיקר בכפיס המוח. יש מגבלות בלימוד כפיס המוח כאתר של חידוש יצירת המיאלין מהסיבות הבאות: ראשית, קטרי האקסון (ובכך עובי המיאלין) הם קטנים יותר מאשר אזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, ונדנים כך remyelinated דק יכולים להיות שאין להבחין בין אלה שאף פעם לא היו demyelinated. שנית, משום שכפיס מוח העכבר מכיל אקסונים unmyelinated> 70% 16, זה יכול להיות לא ברור אם קטע remyelinated הוא תיקון אמיתי של המיאלין נפגע או דה נובו סינתזת המיאלין במבוגרים, אשר מתרחש בדרך כלל 17.
זה האמונה שלנו שהמודל הטוב ביותר ללימוד חידוש יצירת המיאלין הוא ההזרקה הישירה של רעלים, או lysolecithin, ethidברומיד ium, או אחר, לpeduncles הזנב המוחית 18 או חומר לבן בחוט השדרה. המיקום לשעבר מושגת רק על ידי הזרקת stereotactic 3-ממד מדויק, ומוגבל למכרסמים גדולים יותר (חולדות) בשל גודלו הקטן של peduncles המוח הקטן. זה אינו כולל את המשאב הנרחב של עכברים הטרנסגניים בלימוד דה וחידוש יצירת המיאלין. חוט השדרה, לעומת זאת, מכיל קטעים רבים גדולים חומר לבנים כי הם בקלות בניתוח נגיש. רווחים בין החוליות במגזר החזה מקורי מאפשרים חשיפה של חוט השדרה ללא הצורך בlaminectomy, אשר הוא צעד הכרחי בפרוצדורות כירורגיות בבית חזה הזנב. יתרון של מיקוד ספציפי בחומר לבן הגחון הוא שהאקסונים הם אחיד יותר גדולים מהחומר לבן גב, מה שהופך את הכימות של חידוש יצירת המיאלין פחות מעורפל משימה דומה לאתגרים הקשורים בכפיס המוח. בנוסף, החומר לבן הגחון מפצה t הרבה יותר גדולarget אזור להזריק; כמה מאה מיקרונים רוחבי באזור הגב יעמידו את הנימים מחוץ לטור, ואילו באותו הסטייה ventrally עדיין לייצר נגע demyelinating בולט. פרוטוקולים כמה להזריק lysolecithin לשני הגב וגחון עמודות של אותה החיה 19. זה יכול להגדיל הן את הסבירות למיקום נימים נכונה ומספר הנגעים לכימות בפחות בעלי חיים. בעוד שהנתונים הנוכחיים המוצגים הנו מבעלי חיים ישנים 8-10 שבוע בזמן של פעולה, גם היה לנו הצלחה באותו אופן על עכברים ישנים 8-10 חודשים, שבו חידוש יצירת המיאלין מתואר כניכר איטי 4.
כימות של חידוש יצירת המיאלין היא לא התחייבות של מה בכך. דוגמה מרכזית טוענת כי מגזרי remyelinated הם קצרים יותר באורך ודק יותר בממוצע מאשר עמיתיהם הבריאים, ולכן חישובי g-יחס (בקוטר האקסון מחולק בהאקסון + קוטר מיאלין) של חתך רוחב-למחצה oסעיפי Ultrathin r הפכו הליך סטנדרטי. עם זאת, ידוע כי מגזרי remyelinated לעבות לאורך זמן 2 ומחקר שנערך לאחרונה באמצעות כתב מהונדס של oligodendrocytes remyelinating עולה כי internodes רב הפך סופו של הדבר שאין להבחין בין שליטה 20. כימות מספר oligodendrocytes הבוגרת בתוך הנגע היא דרך עקיפה למדידת תיקון, כoligodendrocytes מסוגלת לעשות מספר רחב של internodes, וחלק משמעותי במודל בהתאם-חידוש יצירת המיאלין משומש יכול להתרחש מתאי שוואן 3. כמובן, כמו חידוש יצירת המיאלין נקשר לשיקום הולכה הקופצנית 21, המדד האולטימטיבי של תיקון יהיה התאוששות תפקודית של גירעונות נוירולוגיות. בעוד חידוש יצירת המיאלין נקשר להתאוששות של תפקוד בכמה מינים 22,23, זה לא הפך הליך סטנדרטי במחקרי lysolecithin עכבריים. זה כנראה עקב חוסר observ הגלויגירעונות מסוגלים מנגעים או הגבי או הגחון, בהשוואה לדגמי demyelination חזקים יותר כגון EAE ואפילו cuprizone. אנו מאמינים כי ליקויים תפקודיים הנובעים מlysolecithin הזרקה, והתאוששות שלאחר מכן עם חידוש יצירת המיאלין, יהיו רק נצפים באמצעות בדיקות רגישות של תפקוד הסנסורית בסדר.
חיפוש PubMed של "חידוש יצירת המיאלין" לצד אחד מהמודלים של בעלי החיים המפורטים לעיל, אם כי גישה מתודולוגית גסה, תערוכות להיטי חיפוש פחות לlysolecithin (109) בהשוואה לEAE (188) וcuprizone (197). אם הטענה שלנו שlysolecithin demyelination הוא הגישה מעולה ללימוד חידוש יצירת המיאלין, למה זה דן לפחות? אולי חשש לשימוש בשיטה זו נובע מאמונה של קושי טכני בביצוע הפעולה כירורגית. למעשה, הליך זה הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ואין קשה יותר מנתיחת רקמה שגרתית, הדורש חומרים שהם כל commerזמין בייחוד-. תקוותנו הוא כי פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור אלה שרוצים להוסיף מודל זה חזק לרפרטואר שלהם ללימוד תחום המרתק והרחבת של תיקון המיאלין.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
clippers | Philips | QG3330 | |
heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
surgical tape | 3M | 1527-1 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
scalpel blade | Feather | No. 15 | |
sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
cryostat | Leica | CM1900 | |
microscope slides | VWR | 48311-703 | |
bright field microscope | Olympus | BX51 | |
ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
PBS | Oxoid | BR0014 | |
isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
ketamine | CDMV | ||
xylazine | CDMV | ||
iodine | West Penetone | 2021 | |
Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
sucrose | Sigma | S5016 | |
Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
horse serum | Sigma | H0146 | |
glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
corn oil | Sigma | C8267 | |
polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
glycerol | Sigma | G9012 | |
cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
Recipes | |||
Eriochrome cyanine solution | |||
Ingredient | Amount to add | ||
Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
water | 80 mL | ||
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
Gelvatol | |||
Ingredient | Amount to add | ||
PBS | 140 mL | ||
polyvinyl alcohol | 20 g | ||
glycerol | 40 g | ||
*mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |