La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

El pez cebra (cepa nácar) fueron criados y se crió según los protocolos establecidos. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento, utilizando 0,4 mM tricaína para la anestesia y 1 tricaína mM para la eutanasia. Embriones de pez cebra y larvas fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales según lo aprobado por la comisión competente (Laboratorio Biológico MDI animales núcleo CICUAL número 13-20). Este estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación del Genoma Humano Cuidado de Animales y el empleo Comisión Nacional, MDIBL Aseguramiento Institucional # A-3562-01 bajo el protocolo # 14-09. Nota: El procedimiento de imagen que captura la regeneración de la aleta en larvas de pez cebra se resume en los siguientes pasos: 1. Aumento de pez cebra a fases larvarias Recoger los huevos y coloque aproximadamente 50 huevos en una placa de Petri de 100 x 25 mm que contiene 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada suplementado con 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N en una incubadora a 28,5 °. <li> A la mañana siguiente a eliminar los embriones muertos con una pipeta de vidrio y enjuague los huevos en un colador con un 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada (medio embrión llamado). Nota: Medium, como timbres 18, Hanks 18, 19 E2, E3 20, y Danieau 21 puede ser preferible. sup> Añadir medio de embriones frescos al plato. Si la utilización de cepas pigmentadas, añadir opcionalmente 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), como PTU evitará la melanogénesis y por lo tanto la pigmentación de las larvas. Deje que los embriones se desarrollan más en la incubadora hasta 2 días después de la fecundación o cualquier otra etapa larval deseado. 2. Preparación de la cámara de imágenes Método 1: Imaging cámaras hechas de PVC o tubo de teflón (Figura 1) Nota: Este método es similar a la Concha y Adams (1998) 22. Adquirir plástico de calidad del agua de consumo o tubos de teflón en una ferretería con un exterior 25 mmda 20 mm de diámetro interior. Cortar el tubo para hacer anillos de aproximadamente 10 mm de espesor con una superficie uniforme en cada lado. Utilice> 200 papel de lija para suavizar los bordes. Limpie los anillos con agua tibia y etanol al 70% y dejar secar al aire. Con una punta de pipeta, aplicar grasa de silicona a la mitad de un anillo y conecte el anillo a un 75 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio. También puede utilizar una jeringa de 3 ml lleno de grasa de silicona en lugar de una punta de pipeta. Nota: Debido a que es difícil insertar la grasa de silicona en la jeringa 3 ml, añadir la grasa de silicona a una jeringa de 30 ml primero y utilizar este para el llenado de la jeringa 3 ml. Método 2: Preparación de un plato Petri como una cámara de imágenes. Adquirir 35 o 60 mm de diámetro placas de Petri con un cubreobjetos de vidrio unido a la tapa (Figura 2A). Alternativamente, como se muestra en la Figura 3 de Distel y Koester (2007) 23, perforar una abertura lo suficientemente pequeño para hviejo un cubreobjetos en la tapa de una pequeña placa de Petri y aplicar grasa de silicona al exterior con una jeringa de 3 ml. Utilizando una punta de pipeta limpia, con cuidado colocar un cubreobjetos redondo o cuadrado de espesor deseado hacia el exterior (Figura 2B). Para asegurarse de que la agarosa se utiliza para estancias firmemente unidos durante la elaboración de montaje, coloque una malla de plástico fino en el interior del anillo. En primer lugar, cortar la malla hecha de pantalla de la ventana obtenido a partir de una ferretería, en el tamaño del diámetro del anillo interior con unas tijeras finas con un ángulo. A continuación, cortar un pequeño rectángulo> dos veces el tamaño de la larva en el centro de la malla (Figura 1, 2). Aplicar cuatro pequeños puntos de grasa de silicona no tóxico para la interfaz entre la hoja de la cubierta y el anillo de la cámara (Figura 1A). El uso de fórceps para sujetar firmemente la malla a la parte inferior de la cubreobjetos de vidrio. 3. Montaje e Imagen de la Pre-injured Larva (este paso es opcional) Nota: Este paso es adecuado para las comparaciones entre la longitud de la aleta amputada y regenerada, como el plano de amputación después de la regeneración de la aleta no es reconocible en larvas de pez cebra. Preparar una solución de agarosa al 0,5-1,2% bajo punto de fusión en medio de embrión para la inmovilización de la muestra. Calentar la agarosa en un microondas y transferir la agarosa líquido en tubos de 1,5 ml que se pre-calienta a 42 ° C en un calentador. Deje que la agarosa caliente, déjelo enfriar a 42 ° C, que puede mantenerse durante varias semanas a esta temperatura. Trate de evitar pipetear las larvas en agarosa encima 42 ° C, ya que esto será perjudicial para los animales. Anestesiar a varias larvas usando 10 ml de 0,4 mM tricaína (pH 7) en medio de embrión en una placa de Petri de diámetro 60 mm. Prepare el tricaína según el Libro Recetas de pez cebra 18. Alternativamente, utilizar 10 ml de una dilución 1: 1000 de 99% 2-fenoxietanol en una placa Petri de diámetro de 60 mm. Meter las larvas con una punta de pipeta microloader nevadas para evaluar su respuesta al tacto antes de proceder. Utilice sólo las larvas no responde. Transferir una larva en la solución de gelosa a 42 ° utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. No transfiera líquido excesivo en la agarosa, de lo contrario la agarosa será demasiado diluida y se solidifica. Deseche el líquido restante de la pipeta y transferir la larva con una gota de agarosa en una pequeña placa de Petri (35 o 60 mm de diámetro). Coloque la larva en su lado de la imagen de la aleta caudal. Deje que la agarosa se solidifique. Evaluar la agarosa con una punta de pipeta de plástico; la punta se sumerja en la agarosa si es demasiado líquido. Una vez que la agarosa se ha solidificado, una pequeña hendidura será visible al tocar con la punta de la pipeta. Después de la solidificación, añadir solución tricaína y proceder al microscopio estereoscópico que se utilizará más tarde para time-lapse. <br /> Nota: Este paso también se puede realizar mediante la colocación de la larva anestesiado en un plato Petri revestido con 1,5% de agarosa en medio de embrión. Utilice un microscopio estereoscópico con el software de lapso de tiempo. Seleccione un objetivo y ampliación apropiado, que se utilizará más tarde para time-lapse. En este caso, utilice un 3,5 x 16 mm, distancia de trabajo de la lente objetivo en un microscopio estereoscópico. Según se desee, utilizar microscopios alternativos y lentes de objetivos, sino elegir un aumento adecuado para tener en cuenta el potencial xy de la deriva y el crecimiento de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes. Seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio. En el software, seleccione el modo "en vivo" para ver la larva en la pantalla. Abra la ventana "Propiedades" para detectar automáticamente el brillo. Para ajustar manualmente el contraste en la base trans-iluminación microscopio. Mueva la larva del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado para minimizar fondo noise. Coloque la larva de nuevo en el campo de visión y tomar una instantánea. Guarda la imagen. Retire la agarosa de la larva por primera raspando la agarosa de la cabeza. De esta forma la larva puede deslizarse fuera de la agarosa tirando suavemente la cabeza lejos de la agarosa restante con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. Con una pipeta Pasteur de vidrio transferir la larva en una solución tricaína fresco. 4. Amputación Ensayo Preparar una solución de agarosa al 1,5% usando medio de embrión y se vierte una capa delgada en una placa de Petri. Deje que la agarosa se solidifique. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque el lateral larva en la agarosa solidificada y amputar la aleta de la cola con una G aguja de la jeringa 23 con una ligera presión (Figura 3A). 5. Montaje de la Larva de time-lapse Proceda como se describe en los pasos 3.1 a 3.5 (Figura 3B). <li> Transferir una caída de 0,5 a 1,2% de agarosa líquida a 42 ° C que contiene la larva en el anillo de la cámara de imágenes (paso 2.1), oriente la larva y dejar que la agarosa se solidifique. Llene el anillo con solución tricaína. Alternativamente, si se utiliza la cámara de placa de Petri (paso 2.2), montar la larva en el cubreobjetos tapa y llenar la tapa con solución tricaína. Para permitir la cicatrización de las heridas o la regeneración de tejidos que se produzca, raspar con cuidado la agarosa que rodea la aleta de la cola distal con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. Trate de no lesionar la aleta repetidamente (Figura 3C). Decantar la solución tricaína contiene el eliminado de agarosa y llenar el anillo de la cámara con solución tricaína fresco. Aplicar grasa de silicona a la parte superior del anillo y adjuntar una cámara de 75 mm x 25 mm portaobjetos de vidrio. Trate de evitar las bolsas de aire en la cámara, ya que interferirán con las imágenes de campo claro y desecar la larva en el tiempo. Si se utiliza una placa de Petri comouna cámara de formación de imágenes, se aplica grasa de silicona para el borde superior de la cámara inferior y llenar la cámara inferior con la solución de tricaína. Decantar cuidadosamente la solución tricaína en la tapa y gire la tapa sobre sumergir la larva en la solución tricaína de la cámara inferior en un ligero ángulo para evitar bolsas de aire. La cámara será sellado debido a la grasa de silicona. Imagen 6. Time-lapse Montar una cámara de incubación se calienta como se describe en 23,24 (Figura 4) .Colocar la cámara de incubación alrededor del microscopio y encender la calefacción. Ajustar la temperatura a 28 ° C durante aproximadamente 10 a 20 minutos o hasta que la temperatura se ha estabilizado. Abra la parte delantera de la cámara de incubación climatizada y colocar la cámara de imágenes en el soporte microscopio con el cubreobjetos hacia arriba hacia el objetivo. Coloque la aleta larval de una manera que 2/3 de la campo de visión permanece desocupado. Esto asegura la captura de lacrecimiento y la regeneración de la aleta en el transcurso del procedimiento de formación de imágenes sin tener que cambiar la posición de la larva. Ajuste la larva montado a 28 ° C durante ~ 30 minutos antes de iniciar la grabación a intervalos regulares para evitar cambios en la intensidad de campo claro o posibles cambios de la agarosa. Alternativamente, utilizar tampón de pre-calentado para comenzar de formación de imágenes después de corto tiempo de ajuste. Para configurar la grabación de lapso de tiempo, abra la ventana 6D Multidimensional Adquisición en el software Axiovision y seleccione la opción z-stack y time-lapse. Opcional) En la pestaña z-pila y Modo Loncha, seleccione el grosor de corte y luego seleccionar el modo de inicio / parada. Definir la posición superior e inferior de la pila. En la pestaña de lapso de tiempo, seleccione el intervalo y la duración de la película y luego comenzar la película pulsando el botón de inicio. Encontramos que intervalos de 30 minutos son suficientes y este intervalo no genera datos excesivos; Sin embargo shorteintervalos R pueden ser utilizados. Compruebe las dimensiones de posición y z-stack durante la primera hora si la larva no fue pre-ajustado. Si es necesario, vuelva a colocar la larva de nuevo después de un día, como la larva puede haber cambiado. Guarde el archivo al final de la grabación a intervalos regulares y proceder con el post-procesamiento y cuantificaciones utilizando el software de análisis de imágenes disponibles, como Imaris 25 o el código abierto paquetes de software Image J 26 y 27 de Fiji. Análisis 7. Datos La determinación de la longitud de la aleta. Abre la película de lapso de tiempo en el software de imagen y guardar los archivos en el formato de archivo propietario para mejorar el rendimiento del software. Seleccione la vista ortogonal a mostrar secciones individuales como pilas proyectadas. Para la corrección de la deriva, en el menú de Fiji, seleccione Complementos y Registro, y 'deriva 3D correcta'. Esto abrirá una ventana de Fiji y realizar las correcciones de deriva. Correctoderiva de rotación en la función Spots Imaris. Alternativamente, instalar los plugins StackReg y TurboReg en la imagen J e importar a Fiji. Elija el algoritmo de transformación deseada en el plugin StackReg. Para medir distancias (por ejemplo, diámetro de la herida o la longitud de la aleta), seleccione la opción "agregar nuevos puntos de medición" en la barra de herramientas de la izquierda superior. En 'lista Configurar de Estadísticas visibles Valores' en el menú inferior izquierda, seleccione los valores de los estadísticos que se mostrarán. En el "Modo de línea" bajo la pestaña Configuración, seleccione 'pares (AB, CD …). En 'Labels Propiedades' select 'Nombre' y 'Distancia', para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición. Cambie al modo "Editar" y mantenga presionado el botón de desplazamiento para seleccionar el primer punto al final de la notocorda. A continuación, utilice la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el margen distal de la aleta. En la pestaña "Estadísticas", seleccione el botón de disco (Exportar todo) en la parte inferior derecha para mostrar y exportar la distancia en la imagen. Repita las mediciones a la hora seleccionada moviendo el deslizador por debajo de la imagen de la derecha. En lugar de crear nuevos puntos de medición, los anteriores se pueden reposicionar primero seleccionando el punto con el botón izquierdo del ratón, a continuación, al mismo tiempo presionando el desplazamiento y el botón izquierdo del ratón en la nueva posición. Como alternativa a la opción Puntos de Medición, utilizar el espectador rebanada para medir distancias. En el modo de vista de la rebanada, desplácese hasta la posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón. Se mostrará la distancia. Esta opción sin embargo no permite la exportación de datos. La determinación de longitud de la aleta y el área en ImageJ. Abre la película de lapso de tiempo en ImageJ usando un plugin que reconoce el formato de archivo .zvi. Como alternativa, cargue en un Quarchivo ickTime o secuencia tiff. Nota: Si utiliza un formato de archivo TIFF sin comprimir, las dimensiones de la imagen no es necesario que se determine. Si la apertura de un formato de archivo diferente sin la información del archivo, seleccione "Escala de Ajuste" en el menú "Analizar" para definir primero la distancia de la imagen y la unidad. En el 'menú Escala Set', escriba el 'Distancia en píxeles ", a continuación el tipo de la" distancia Conocido' para el valor de píxel (esto se puede obtener midiendo el número de píxeles en una barra de escala que se ha añadido a la imagen , a continuación, haga clic en Medir para obtener el resultado), y la "Unidad de longitud '(normalmente' m '). Luego haga clic en Aceptar. Para mediciones de área de aleta seleccionar la herramienta "Selección a mano alzada" en la barra de herramientas y describen el área de la aleta manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras dibuja a lo largo del contorno de la aleta. Para mediciones de la longitud de la aleta, seleccione la herramienta de línea de 'Straight "y trazar una línea entre los puntos deseados para sermedido. Haga clic en la opción "Medir" en "Analizar" para visualizar el área y la longitud de la aleta. Repita este paso tantas veces como sea necesario para múltiples puntos de tiempo de la película. Utilizando las estadísticas de software, los datos pueden visualizarse gráficamente.