Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Zebrafish (ceppo madreperla) sono stati allevati e cresciuto secondo i protocolli stabiliti. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza, con 0,4 Tricaine mM per l'anestesia e 1 Tricaine mM per l'eutanasia. Zebrafish embrioni e larve sono state gestite in stretto accordo con le buone pratiche animale come approvato dalla commissione competente (Laboratorio MDI Biological animale nucleo IACUC numero 13-20). Questo studio è stato approvato dall'Istituto Human Genome Research cura degli animali e uso Comitato Nazionale, MDIBL istituzionale Assurance # A-3562-01 sotto protocollo # 14-09. Nota: La procedura di imaging in grado di catturare la rigenerazione pinna zebrafish larvale è riassunta nei seguenti punti: 1. Raccolta di Zebrafish di stadi larvali Raccogliere le uova e mettere circa 50 uova in una capsula di Petri di 100 x 25 mm contenente 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata integrato con 0,00004% blu di metilene. Incubare O / N in un incubatore a 28.5 °. <li> Il mattino dopo rimuovere gli embrioni morti con una pipetta di vetro e lavare le uova in un colino con il 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata (medio dell'embrione chiamato). Nota: Media come Ringers 18, Hanks 18, E2 19, E3 20, e Danieau 21 può essere preferibile. sup> Aggiungi medio embrione fresco al piatto. Se utilizzando ceppi pigmentati, opzionalmente aggiungere 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), come PTU impedirà melanogenesi e quindi la pigmentazione delle larve. Lasciate che gli embrioni si sviluppano ulteriormente in incubatrice fino a 2 giorni dopo la fecondazione o qualsiasi altra fase larvale desiderato. 2. Preparazione di sezione Imaging Metodo 1: Imaging camere in PVC o tubi in Teflon (Figura 1) Nota: Questo metodo è simile a Concha e Adams (1998) 22. Acquisire grado di plastica di acqua potabile o di tubi in Teflon da un negozio di ferramenta con una esterna 25 millimetrida 20 millimetri di diametro interno. Tagliare il tubo per fare anelli di circa 10 mm di spessore con una superficie piana su ogni lato. Utilizzare> 200 carta vetrata a grana per lisciare i bordi. Pulire gli anelli con acqua calda e il 70% di etanolo e lasciare asciugare all'aria. Con un puntale, applicare grasso al silicone alla metà di un anello e fissare l'anello a x 25 mm vetrino di vetro 75 mm. In alternativa, utilizzare una siringa da 3 ml riempita con grasso al silicone al posto di una punta della pipetta. Nota: Poiché è difficile inserire il grasso siliconico nella siringa 3 ml, aggiungere il grasso al silicone in una siringa da 30 ml prima e di utilizzare per il riempimento della siringa 3 ml. Metodo 2: Preparazione di un piatto Petri come camera di imaging. Acquisire 35 o 60 mm di diametro Petri con un coprioggetto di vetro fissato al coperchio (Figura 2A). In alternativa, come illustrato nella figura 3 Distel & Koester (2007) 23, praticare un'apertura piccola abbastanza da hvecchio un coprioggetto nel coperchio di una piccola capsula di Petri e applicare grasso al silicone all'esterno con una siringa 3 ml. Usando una pipetta pulita, applicare accuratamente una rotonda o quadrata coprioggetto di spessore desiderato verso l'esterno (Figura 2B). Per garantire che l'agarosio utilizzato per soggiorni saldamente attaccati durante la procedura di imaging di montaggio, collegare una rete di plastica multa all'interno dell'anello. In primo luogo, tagliare la maglia fatta di schermo di finestra ottenuto da un negozio di ferramenta, nella dimensione del diametro dell'anello interno con le forbici bene con un angolo. Poi tagliare un piccolo rettangolo> due volte la dimensione della larva al centro della maglia (figura 1, 2). Applicare quattro piccoli punti di grasso al silicone non tossico per l'interfaccia tra il vetrino e l'anello camera (Figura 1A). Usare pinze per fissare la maglia saldamente al fondo del vetrino di vetro. 3. Montaggio e imaging del Pre-injrato Larva (questo passaggio è facoltativo) Nota: Questo passaggio è adatto per il confronto tra la lunghezza della pinna amputata e rigenerata, mentre l'aereo amputazione dopo la rigenerazione pinna non è riconoscibile in larve di zebrafish. Preparare una soluzione di agarosio 0.5-1.2% bassofondente nel mezzo embrioni per l'immobilizzazione del campione. Riscaldare l'agarosio in un forno a microonde e trasferire il liquido in agarosio 1,5 ml tubi che vengono pre-riscaldato a 42 ° C in un blocco di riscaldamento. Sia l'agarosio calda raffreddare a 42 ° C, che può essere mantenuta per diverse settimane a questa temperatura. Cercate di evitare pipettare le larve in agarosio sopra 42 ° C, in quanto questo sarà dannoso per gli animali. Anestetizzare vari larve utilizzando 10 ml di 0,4 Tricaine mM (pH 7) in mezzo embrione in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Preparare il Tricaine secondo le Zebrafish libro Ricette 18. In alternativa, utilizzare 10 ml di una diluizione 1: 1000 99% 2-fenossietanolo in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Poke le larve con una punta microloader pipetta capped per valutare la loro risposta al tocco prima di procedere. Utilizzare solo le larve non risponde. Trasferire una larva nel C soluzione di agarosio 42 ° con una pipetta Pasteur di vetro. Non trasferire il liquido eccessivo nella agarosio, altrimenti il ​​agarosio sarà troppo diluito e non solidificare. Eliminare il liquido rimanente dalla pipetta e trasferire la larva con una goccia di agarosio in una piccola scatola di Petri (35 o 60 mm di diametro). Posizionare la larva su un lato per l'imaging della pinna caudale. Lasciare che il agarosio solidificare. Valutare l'agarosio con una pipetta di plastica; la punta si immergono nel agarosio se è troppo liquido. Una volta che l'agarosio si è solidificato, una piccola rientranza sarà visibile dopo aver toccato con la punta della pipetta. A seguito di solidificazione, aggiungere la soluzione Tricaine e procedere alla stereomicroscopio che verrà utilizzato in seguito per l'imaging time-lapse. <br /> Nota: Questa fase può essere eseguita anche posizionando la larva anestetizzato su un piatto Petri rivestito con 1,5% agarosio in mezzo embrione. Utilizzare uno stereomicroscopio con software time-lapse. Selezionare un obiettivo e l'ingrandimento del caso, che sarà utilizzato in seguito per l'imaging time-lapse. Qui, utilizzare un 3.5 x 16 millimetri, distanza di lavoro lente obiettiva su uno stereomicroscopio. Come desiderato, utilizzare microscopi alternativi e lenti dell'obiettivo, ma scegliere un ingrandimento adeguato per tenere conto di potenziali xy-drift e la crescita della pinna durante la procedura di imaging. Selezionare la modalità di rilevazione telecamera sul microscopio. Nel software, selezionare la modalità 'live' per vedere la larva sullo schermo. Aprire la finestra 'Proprietà' per rilevare automaticamente la luminosità. Regolare manualmente il contrasto al microscopio trans-illuminazione di base. Spostare la larva fuori del campo visivo e selezionare la funzione Correzione Shading per minimizzare sfondo noise. Posizionare la larva di nuovo nel campo visivo e scattare una foto. Salvare l'immagine. Rimuovere l'agarosio dalla larva dalla prima raschiando il agarosio la testa. In questo modo la larva può essere scivolato fuori dal agarosio tirando delicatamente la testa dal agarosio rimanente con una ridotta punta microloader pipetta o un perno insetto. Con una pipetta Pasteur di vetro trasferire la larva in soluzione Tricaine fresco. 4. Amputazione Assay Preparare una soluzione di agarosio 1,5% con media embrione e versare uno strato sottile in una capsula di Petri. Lasciate che il agarosio solidificare. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare il sideward larva sul agarosio solidificato e amputare la pinna di coda con un G siringa 23 con una leggera pressione (Figura 3A). 5. Montaggio del Larva per Time-lapse imaging Procedere come descritto nei passaggi 3,1-3,5 (Figura 3B). <li> Trasferire un calo del 0,5-1,2% agarosio liquido a 42 ° C contenente la larva nell'anello camera di imaging (passo 2,1), orientare la larva e lasciare che il agarosio solidificare. Riempire l'anello con soluzione Tricaine. In alternativa, se la camera di scatola di Petri (punto 2.2) è utilizzato, montare la larva sul vetrino coperchio e riempire il coperchio con la soluzione Tricaine. Per consentire una corretta guarigione della ferita o la rigenerazione dei tessuti a verificarsi, raschiare con cura l'agarosio circonda la pinna caudale distale con un tappo tip microloader pipetta o un perno insetto. Cercate di non danneggiare la pinna ripetutamente (Figura 3C). Decantare la soluzione Tricaine contenente il rimosso agarosio e riempire l'anello da camera con soluzione Tricaine fresca. Applicare grasso al silicone all'inizio dell'anello camera e collegare un x 25 mm vetrino 75 mm. Cercate di evitare sacche d'aria nella camera, in quanto interferiscono con l'imaging campo chiaro e essiccare la larva nel tempo. Se si utilizza una capsula di Petri comeuna camera di imaging, applicare grasso al silicone al bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera inferiore con soluzione Tricaine. Decantare attentamente la soluzione Tricaine nel coperchio e ruotare il coperchio verso immergere la larva nella soluzione Tricaine della camera inferiore con una leggera angolazione per evitare sacche d'aria. La camera viene sigillato a causa del grasso al silicone. 6. Time-lapse imaging Assemblare una camera di incubazione riscaldata come descritto in 23,24 (figura 4) .Rimontare camera umida intorno al microscopio e accendere il calore. Regolare la temperatura a 28 ° C per circa 10 – 20 min o fino a quando la temperatura si è stabilizzata. Aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di imaging sul supporto microscopio con coprioggetto rivolto verso l'alto verso l'obiettivo. Posizionare la pinna larvale in modo che 2/3 del campo visivo rimane non occupato. Questo assicura la cattura delcrescita e la rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging senza dover riposizionare la larva. Regolare la larva montato a 28 ° C per ~ 30 minuti prima di iniziare la registrazione time-lapse di evitare cambiamenti di intensità campo chiaro o potenziali spostamenti della agarosio. In alternativa, utilizzare buffer di pre-riscaldato per avviare l'imaging dopo tempo di regolazione più brevi. Per impostare la registrazione time-lapse, aprire la finestra 6D Multidimensionale acquisizione nel software AxioVision e selezionare l'opzione z-stack e time-lapse. Opzionale) Nella scheda z-stack e modalità Slice, selezionare lo spessore della fetta e quindi selezionare la modalità di Start / Stop. Definire la posizione superiore e inferiore della pila. Nella scheda time-lapse, selezionare l'intervallo e la durata del film e quindi avviare il filmato premendo il pulsante di avvio. Abbiamo scoperto che intervalli di 30 min sono sufficienti e questo intervallo non genera dati eccessivo; tuttavia shortepossono essere utilizzati intervalli r. Controllare le dimensioni di posizione e z-stack durante la prima ora, se la larva non è stato pre-regolato. Se necessario, riposizionare la larva dopo un giorno, come la larva può essere spostato. Salvare il file alla fine della registrazione time-lapse e procedere con la post-elaborazione e quantificazioni utilizzando disponibili software di analisi dell'immagine, come ad esempio Imaris 25 o l'open source software Immagine J 26 e 27 Fiji. Analisi 7. I dati Determinare la lunghezza della pinna. Aprire il filmato time-lapse nel software di imaging e salvare i file nel formato file proprietario per migliorare le prestazioni del software. Selezionare la vista ortogonale per visualizzare le sezioni individuali come stack proiettate. Per la correzione della deriva, sotto il menu Fiji, selezionate Plugin, quindi registrazione, e 'corretto deriva in 3D'. Si aprirà una finestra Fiji ed effettuare le correzioni di deriva. Correttoderiva di rotazione in funzione Spots Imaris. In alternativa, installare i plugin StackReg e TurboReg in immagine J e importare a Fiji. Scegliere l'algoritmo trasformazione desiderata nel plugin StackReg. Per misurare le distanze (ad esempio, diametro della ferita o lunghezza fin), selezionare l'opzione 'aggiungere nuovi punti di misura "nella barra degli strumenti in alto a sinistra. Sotto 'lista Configura Statistiche visibili valori' nel menu in basso a sinistra, selezionare i valori delle statistiche da visualizzare. Nella 'Modalità Line' nella scheda Impostazioni selezionare 'Pairs (AB, CD …). In 'Etichette Proprietà' select 'Nome' e 'Distance', per mostrare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misura. Passare alla modalità 'Modifica' e tenere premuto il tasto Maiusc per selezionare il primo punto alla fine della notocorda. Quindi utilizzare la stessa configurazione per selezionare il secondo punto sul margine distale della pinna. Nella scheda 'Statistiche', selezionare il pulsante del disco (Esporta tutto) in basso a destra per visualizzare ed esportare la distanza nell'immagine. Ripetere le misurazioni a volte selezionati spostando il cursore sotto l'immagine a destra. Invece di creare nuovi punti di misura, quelli precedenti possono essere riposizionati selezionando prima il punto con il tasto sinistro del mouse, quindi contemporaneamente premendo il cambio e il tasto sinistro del mouse nella nuova posizione. In alternativa all'opzione punti di misura, utilizzare lo spettatore fetta per misurare le distanze. Nella modalità di visualizzazione fetta, scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e seconda posizione con il tasto sinistro del mouse. Verrà visualizzata la distanza. Questa opzione però non consente l'esportazione di dati. Determinare la lunghezza della pinna e l'area in ImageJ. Aprire il filmato time-lapse in ImageJ utilizzando un plugin che riconosce il formato di file .zvi. In alternativa, caricare in un Qufile di ickTime o una sequenza tiff. Nota: Se si utilizza un formato di file TIFF non compresso, le dimensioni dell'immagine non devono essere specificati. Se l'apertura di un formato di file diverso senza le informazioni sul file, selezionare 'Set Scale' nel menu 'Analizza' per definire prima la distanza dell'immagine e l'unità. Nel 'Set menu Scala', digitare il 'Distanza in pixel', sotto digitare la 'distanza nota' per il valore di pixel (questo può essere ottenuto misurando il numero di pixel su una barra di scala che è stato aggiunto all'immagine , quindi fare clic su Misura per ottenere il risultato), e la 'Unità di lunghezza' (tipicamente 'micron'). Quindi fare clic su OK. Per pinna misurazioni dell'area selezionare lo strumento 'selezione a mano libera' nella barra degli strumenti e delineano l'area fin tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si disegna lungo il contorno della pinna. Per le misure di lunghezza pinna, selezionare la 'dritta' strumento linea e tracciare una linea tra i punti desiderati per esseremisurata. Selezionare l'opzione 'Misura' sotto 'Analizza' per visualizzare l'area e la lunghezza della pinna. Ripetere questo passo con la frequenza necessaria per più punti di tempo del film. Utilizzando le statistiche software i dati possono essere visualizzati graficamente.