タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

ゼブラフィッシュ（ 真珠層株 ）が確立されたプロトコルに従って飼育し提起された。すべての努力は安楽死のための麻酔および1mMトリカインのために0.4 mMのトリカインを使用して、苦痛を最小限にするために行われた。適切な委員会（MDI生物学研究所の動物のコアIACUC番号13-20）によって承認されゼブラフィッシュ胚および幼生は、良好な動物の練習に厳密に従って取り扱われた。この研究は、プロトコル＃14から09の下に国立ヒトゲノム研究所動物実験委員会、MDIBL機関保証＃は、A-3562から01によって承認された。 注：幼虫のゼブラフィッシュでフィン再生を撮像する撮像手順は、以下のステップに要約されている： 幼虫期にゼブラフィッシュの1.調達卵を収集し、0.00004パーセントメチレンブルーを補足した脱イオン水に0.03％のインスタントオーシャン塩を含有する100×25ミリメートルペトリ皿に約50卵を置きます。 28.5℃のインキュベーター中でO / Nインキュベートします。 <LI>翌朝、ガラスピペットで死んだ胚を除去し、脱イオン水（と呼ばれる胚培地）中で0.03％のインスタントオーシャン塩とストレーナーに卵をすすぐ。 注：好ましい可能性があるようなリンガー18、ハンクス18、E2 19、E3 20、及びDanieau 21の媒体。 SUP>皿に新鮮胚培地を追加します。着色された菌株を使用する場合は、必要に応じてPTUとして、0.2mMの1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を追加し、メラニン形成を防止し、従って幼虫の色素沈着になる。胚がさらに2日後に受精または任意の他の所望の幼虫期まで、インキュベーター内で開発してみましょう。 イメージング商工の調製方法1：PVCまたはテフロンチューブから作られたイメージングチャンバー（ 図1） 注：このメソッドは、コンチャとアダムス（1998）22に似ています。 25ミリメートル、外ANとハードウェアストアから飲料水用プラスチックまたはテフロンチューブを取得ダ20ミリメートルの内径。それぞれの側にあっても、表面に約10mmの厚さのリングを作るためにチューブを切断する。エッジを滑らかにするために> 200グリットサンドペーパーを使用してください。 暖かい水と70％エタノールリングをきれいにし、それらに空気乾燥してみましょう。 ピペットチップで、リングの半分にシリコングリースを適用し、75ミリメートル×25 mmのガラスカバースリップにリングを取り付けます。また、シリコングリスの代わりに、ピペットチップで満たされた3ミリリットル注射器を使用しています。 注：、3 mlシリンジにシリコングリースを挿入する最初の30 mlシリンジにシリコングリースを加え、3 mlシリンジを充填するためにこれを使用することは困難であるからである。 方法2：撮像チャンバとしてペトリ皿の調製。 蓋（ 図2A）に付着したガラスカバースリップで35または60ミリメートル直径のペトリ皿を取得。 DISTEL＆ケスター（2007）23 図3に示すように、代替的に、時間に十分に小さい開口をドリル古い小さなペトリ皿の蓋にカバースリップと3ミリリットルシリンジで外部にシリコングリースを適用します。きれいなピペットチップを使用して、慎重に（ 図2B）を外部に所望の厚さの円形または正方形のカバースリップを添付します。 アガロースがしっかりと撮像手順の間に取り付けられた取り付けステーに使用されていることを確認するには、リングの内側に細かいプラスチックメッシュを取り付けます。まず、角度で細かいハサミを使用して、内側のリング径の大きさに、ハードウェアストアから取得したウィンドウ画面製のメッシュをカット。その後、メッシュの中央に>幼虫の倍のサイズに小さな長方形をカットします（ 図1、2）。 カバースリップとチャンバーリング（ 図1A）との界面に非毒性のシリコングリースの四つの小ドットを適用する。 カバーガラスの底にしっかりとメッシュを取り付けるために鉗子を使用してください。 3.マウントとプリINJのイメージング測定しまし幼虫（この手順はオプションです） 注：フィン再生後の切断面は、ゼブラフィッシュの幼虫で認識できないため、このステップは、切断され、再生フィン長さ間の比較に適しています。 試料の固定化のための胚培地中で0.5から1.2パーセント低融点アガロース溶液を準備します。 電子レンジでアガロースを加熱し、加熱ブロック中で42℃に予め温めている1.5ミリリットルチューブに液体アガロースを移す。 ホットアガロースはこの温度で​​数週間にわたって維持することができ、42℃に冷却させ。これは、動物にとって有害で​​あるように、42℃を超えるアガロースに幼虫をピペット避けるようにしてください。 直径60mmのペトリ皿に胚培地に0.4mMのトリカイン（pHが7）を10mlを使用して複数の幼虫を麻酔。ゼブラフィッシュブックのレシピ18に従ってトリカインを準備します。 99：1000希釈の代わりに、1の10ミリリットルを使用直径60mmのペトリ皿中で％2-フェノキシエタノール。先に進む前に、彼らのタッチレスポンスを評価するために蓋をしmicroloaderピペットチップで幼虫を突く。唯一の非応答幼虫を使用してください。 ガラスパスツールピペットを用いて42℃でアガロース溶液に1幼虫を転送します。そうでなければ、アガロースがあまりにも希釈し、固化していないされ、アガロースに過度の液体を転送しないでください。 ピペットから残留液を捨て、小さなペトリ皿（35または60ミリメートルの直径）にアガロースの一滴で幼虫を転送する。テールフィンの画像化のためにその側に幼虫を置きます。 アガロースが固化することを許可する。プラスチックピペットチップでアガロースを評価する。それはあまりにも液体である場合には、先端をアガロース浸すます。アガロースが固化した後、小さなインデントはピペットチップで触れる時に表示されます。固化後、トリカインソリューションを追加し、タイムラプスイメージングのために後で使用します実体顕微鏡に進みます。 <brは/>注：このステップは、胚培地中で1.5％アガロースでコーティングされたペトリ皿に麻酔した幼虫を配置することによって行われてもよい。 タイムラプスソフトウェアと実体顕微鏡を使用してください。タイムラプスイメージングのために、後に使用される適切な目標と倍率を選択します。ここでは、実体顕微鏡で3.5×、16ミリメートル作動距離対物レンズを使用しています。必要に応じて、別の顕微鏡や対物レンズを利用しますが画像化手順の間に潜在的なXY-ドリフトとフィンの成長を考慮して適切な倍率を選択します。 顕微鏡上のカメラ検出モードを選択します。 ソフトウェアでは、画面上の幼虫を表示するには、「ライブ」モードを選択します。 自動的に明るさを検出するために、「プロパティ」ウィンドウを開きます。 手動顕微鏡トランス照明ベースでのコントラストを調整します。 視野の外に幼虫を移動し、背景なしを最小限に抑えるためにシェーディング補正機能を選択ISE。 バック視野に幼虫を置き、スナップショットを取る。画像を保存します。 第1のヘッドオフアガロースをこすることによって幼虫から​​アガロースを削除します。幼虫はそっと蓋をしmicroloaderピペットチップや虫ピンで残りのアガロースから離れて頭を引いてアガロースを抜け出しすることができますこの方法。 ガラスパスツールピペットで新鮮トリカイン溶液中に幼虫を移す。 4.切断術アッセイ胚培地を用いて1.5％アガロース溶液を調製し、ペトリ皿中に薄層を注ぐ。アガロースが固化してみましょう。 実体顕微鏡下では、固化したアガロース上に幼虫の側方に配置し、わずかな圧力（ 図3A）と23 G注射針を持つテールフィンを切断する。 5.タイムラプスイメージングのための幼虫のマウント 3.5（ 図3B） -ステップ3.1で説明したように実行します。 <li>幼虫の向きを、アガロースを固化させて、画像化チャンバリング（ステップ2.1）に幼虫を含む42℃で0.5から1.2パーセント液体アガロースの低下を転送します。トリカイン溶液でリングを埋める。ペトリ皿室（ステップ2.2）が利用される場合あるいは、蓋カバースリップ上に幼虫をマウントし、トリカイン溶液を蓋を埋める。 適切な創傷治癒または組織再生が起こることを可能にするには、慎重に蓋をしmicroloaderピペットチップや虫ピンを使用して、遠位テールフィンを囲むアガロースを掻き。 （ 図3C）を繰り返しフィンを傷つけないようにしてください。 アガロースを除去し、新鮮なトリカイン溶液でチャンバーリングを埋めるを含むトリカイン液をデカント。 チャンバーリングのトップにシリコングリースを塗布し、75ミリメートル×25 mmのガラススライドを添付します。彼らは明視野イメージングと干渉し、時間をかけて幼虫を乾燥させるように、チャンバ内のエアポケットを避けるようにしてください。 ペトリ皿などを使用している場合イメージング室、下部チャンバーの上部リムにシリコングリースを適用し、トリカイン溶液でボトム室を埋める。慎重にふたにトリカイン液をデカントし、エアポケットを避けるために、わずかな角度でボトム室のトリカイン溶液中に幼虫を浸すように蓋を裏返します。チャンバは、シリコングリースにより密封される。 6.タイムラプスイメージング 23,24（ 図4）顕微鏡を中心にインキュベーションチャンバーを.Placeし、熱をオンに記載されているように加熱されたインキュベーションチャンバーを組み立てます。 20分、または温度が安定するまで – 約10のために28℃に温度を調整します。 加熱されたインキュベーションチャンバーの前面を開いて、目的に向かって上に向けカバーガラスで顕微鏡スタンドへの結像室を配置。 視野の2/3が空い残っている方法で、幼虫のフィンを配置します。これはの捕獲を保証します幼虫の位置を変更することなく撮像手順の過程でフィンの成長および再生。 事前の明視野強度またはアガロースの潜在的なシフトの変化を避けるために、タイムラプス撮影を開始する〜30分間28℃に取り付けられた幼虫を調整します。あるいは、短い調整時間後に撮影を開始するために予め温めたバッファを利用する。 タイムラプス撮影を設定するには、Axiovisionソフトウェアの6D多次元取得ウィンドウを開き、zスタックとタイムラプスオプションを選択します。 zスタックタブとスライスモード時）オプションの、スライス厚を選択し、[開始/停止モードを選択します。 スタックの上下位置を定義する。 タイムラプスタブで、間隔とムービーの継続時間を選択し、スタートボタンを押すことで、ムービーを開始します。我々は、30分間隔で十分であり、この間隔が過剰なデータを生成しないことを見出した。しかしshorterの間隔が使用されてもよい。 幼虫が事前に調整しなかった場合、最初の1時間の位置とzスタックの寸法を確認してください。必要に応じて、幼虫がずれているかもしれませんが、一日の後に再び幼虫の位置を変更。 タイムラプス撮影の終了時にファイルを保存し、後処理などIMARIS 25やオープンソースのソフトウェア·パッケージの画像J 26、フィジー27として、利用可能な画像解析ソフトを用いて定量化を進める。 7.データ解析フィンの長さを決定する。 イメージングソフトウェアにタイムラプスムービーを開き、ソフトウェアのパフォーマンスを向上させるために、独自のファイル形式でファイルを保存します。 投影スタックなど個々のセクションを表示するための直交ビューを選択します。ドリフト補正のために、フィジーのメニューの下に、プラグイン、その後、登録、及び「正しい3Dドリフト」を選択します。これはフィジーウィンドウを開き、ドリフト補正を実行します。正しいIMARISスポット機能で回転ドリフト。また、画像JにおけるSTACKREGとTurboRegプラグインをインストールし、フィジーにインポートします。 STACKREGプラグインで目的の変換アルゴリズムを選択してください。 距離（ 例えば 、創傷直径またはフィン長さ）を測定するには、左上のツール·バーの[追加]新しい測定ポイント」オプションを選択します。 左下のメニューで「目に見える統計値の設定]リスト」の下では、統計値が表示されるように選択します。 設定タブの下の「ラインモード」で「ペア（AB、CDを…）」を選択します。 選択「名前」と「距離」「プロパティラベル」を、測定ラインの隣の点AとBとの間の距離を表示する。 「編集」モードに切り替えて、脊索の終わりに最初のポイントを選択するには、シフトボタンを押したままにします。その後、遠位フィンマージンで第2のポイントを選択するために同じ設定を使用しています。 「統計情報」タブで、画像内の距離を表示し、エクスポートする右下にディスクボタン（すべてエクスポート）を選択します。 右の画像の下のスライダを動かすことで選択された時間での測定を繰り返します。代わりに、新しい測定ポイントを作成するので、以前のものは、最初に新しい位置にシフトし、マウスの左ボタンを押すと同時に、次に、マウスの左ボタンでポイントを選択することで再配置することができる。 あるいは、測定点オプションに、距離を測定するスライスビューアを利用する。スライスビューモードでは、所望の位置にスクロールして、マウスの左ボタンで第一と第二の位置をクリックしてください。距離が表示されます。このオプションでは、しかし、データのエクスポートを許可しません。 ImageJのフィン長さと面積を決定する。 .zviファイル形式を認識し、プラグインを使用してImageJのでタイムラプスムービーを開きます。また、屈原をロードickTimeファイルやTIFFシーケンス。 注：非圧縮のTIFFファイル形式を使用している場合、画像のサイズを指定する必要はありません。 ファイル情報なしで別のファイル形式を開く場合は、最初の像距離と単位を定義するには、 '分析'メニューの下にある「設定するスケール」を選択します。 「ピクセル単位の距離」の「設定スケールメニュー」タイプでは、画素値の「既知の距離」を入力の下に（これは、イメージに追加されたスケールバー上の画素の数を測定することにより得ることができる、その後）の結果を得るために測定クリックして、「長さの単位「（通常は「ミクロン」）。 [OK]をクリックします。 フィン面積の測定は、ツールバーの[フリーハンドの選択」ツールを選択し、フィンの輪郭に沿って描きながらマウスの左ボタンを押したことでフィン面積を概説。フィンの長さの測定のために、「ストレート」ラインツールを選択すること、所望の点の間に線を引く測定された。 フィンの面積と長さを表示するには、「分析」の下に「メジャー」オプションをクリックします。映画の複数の時点のために必要に応じてこの手順を繰り返します。 データをグラフィカルに表示することができる統計ソフトウェアを使用して。