Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Poisson zèbre (souche de nacre) ont été élevés et a grandi selon des protocoles établis. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance, en utilisant mM Tricaine 0,4 pour l'anesthésie et 1 mM Tricaine pour l'euthanasie. Embryons de poisson zèbre et de larves ont été traitées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel qu'approuvé par la commission compétente (Laboratoire de biologie animale de base MDI IACUC numéro 13-20). Cette étude a été approuvée par l'Institut de recherche sur le génome humain soin et l'utilisation des animaux Comité national, MDIBL institutionnelle Assurance # A-3562-01 sous le protocole # 14-09. Remarque: La procédure d'imagerie qui capture la régénération des nageoires chez le poisson zèbre larvaire est résumée dans les étapes suivantes: 1. Résurrection de poisson zèbre pour les stades larvaires Ramasser les oeufs et placez environ 50 oeufs dans un plat 100 x 25 mm de Pétri contenant 0,03% de sel de l'océan instantanée dans l'eau déminéralisée complété par 0,00004% de bleu de méthylène. Incuber O / N dans un incubateur à 28,5 °. <li> Le lendemain matin, retirer les embryons morts avec une pipette en verre et rincer les œufs dans une passoire avec 0,03% de sel de l'océan instantanée dans l'eau déminéralisée (milieu de l'embryon appelé). Note: Medium comme Ringers 18, Hanks 18, 19 E2, E3 20 et Danieau 21 peut être préféré. sup> Ajouter moyen d'embryons frais à l'antenne. Si l'on utilise des souches pigmentées, éventuellement ajouter 0,2 mM de 1-phényl-2-thiourée (PTU), comme PTU mélanogénèse et empêchera ainsi la pigmentation des larves. Laissez les embryons se développent plus loin dans l'incubateur jusqu'à deux jours après la fécondation ou tout autre stade larvaire souhaitée. 2. Préparation de la chambre d'imagerie Méthode 1: Imagerie chambres fabriqués à partir de PVC ou de tuyau en Teflon (Figure 1) Note: Cette méthode est similaire à Concha et Adams (1998) 22. Acquérir plastique de qualité de l'eau potable ou les tubes en téflon d'un magasin de matériel avec un un externe de 25 mmda 20 mm de diamètre intérieur. Couper le tube à faire des bagues d'environ 10 mm d'épaisseur avec une surface plane de chaque côté. Utilisez> 200 papier de verre grain pour lisser les bords. Nettoyez les anneaux avec de l'eau chaude et 70% d'éthanol et les laisser sécher à l'air. Avec une pointe de pipette, appliquer de la graisse de silicium à la moitié d'un anneau et fixez l'anneau à un 75 mm x 25 mm couvercle en verre glissement. Vous pouvez également utiliser une seringue de 3 ml rempli avec de la graisse de silicium au lieu d'une pointe de pipette. Remarque: Comme il est difficile d'insérer la graisse de silicone dans la seringue de 3 ml, ajouter la graisse de silicone à une seringue de 30 ml et en utilisant ce premier remplissage de la seringue de 3 ml. Méthode 2: Préparation d'une boîte de Petri comme une chambre d'imagerie. Acquérir 35 ou 60 mm de diamètre des boîtes de Pétri avec une lamelle de verre fixée au couvercle (figure 2A). En variante, comme le montre la figure 3 de Distel & Koester (2007) 23, percer une ouverture assez petit pour hune lamelle couvre-vieux dans le couvercle d'une petite boîte de Pétri et appliquer de la graisse de silicium vers l'extérieur avec une seringue de 3 ml. En utilisant une pointe de pipette propre, fixez attentivement une forme ronde ou carrée lamelle d'épaisseur désirée à l'extérieur (figure 2B). Pour se assurer que l'agarose utilisé pour des séjours fermement attachés au cours de la procédure d'imagerie de montage, fixez un maillage de plastique fin intérieur de l'anneau. Premièrement, couper la maille en écran de la fenêtre obtenue à partir d'un magasin de matériel, à la taille du diamètre de la bague intérieure à l'aide de ciseaux fins avec un angle. Ensuite, couper un petit rectangle> deux fois la taille de la larve dans le milieu de la maille (figure 1, 2). Appliquer quatre petits points de graisse silicone non-toxique pour l'interface entre la lamelle et l'anneau de chambre (figure 1A). Utilisez une pince pour fixer le treillis fermement au fond de la lamelle de verre. 3. Montage et imagerie de la pré-injme- Larve (cette étape est facultative) Remarque: Cette étape se prête aux comparaisons entre la longueur nageoire amputée et régénéré, que le plan de l'amputation après la régénération des nageoires est pas identifiable dans larves de poisson zèbre. Préparer une solution d'agarose de 0,5 à 1,2% faible point de fusion dans le milieu de l'embryon pour l'immobilisation de l'échantillon. Chauffer l'agarose dans un four micro-ondes et de transférer le liquide d'agarose dans 1,5 ml tubes qui sont pré-chauffé à 42 ° C dans un bloc chauffant. Laissez l'agarose chaude refroidir à 42 ° C, qui peut être maintenu pendant plusieurs semaines à cette température. Essayez d'éviter le pipetage larves dans agarose supérieure à 42 ° C, comme ce sera au détriment des animaux. Anesthésier plusieurs larves en utilisant 10 ml de 0,4 mM tricaïne (pH 7) dans le milieu de l'embryon dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Préparer la tricaïne Selon le livre Recettes de poisson-zèbre 18. Vous pouvez également utiliser 10 ml d'une dilution de 1: 1000 99% 2-phénoxyéthanol dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Poke les larves avec une pointe de pipette microloader plafonné pour évaluer leur réponse au toucher avant de continuer. Utilisez uniquement les larves non recevable. Transférer une larve dans la solution de gélose à 42 C ° à l'aide d'une pipette Pasteur en verre. Ne pas transférer le liquide excessive dans l'agarose, sinon l'agarose sera trop dilué et non solidifier. Jeter le liquide restant de la pipette et transférer la larve avec une goutte d'agarose dans une petite boîte de Petri (35 ou 60 mm de diamètre). Placez la larve de son côté pour l'imagerie de la nageoire caudale. Laisser la gélose se solidifier. Évaluer l'agarose avec une pointe de pipette en plastique; la pointe se immerger dans l'agarose si elle est trop liquide. Une fois que l'agarose est solidifié, une petite indentation sera visible en touchant avec une pointe de pipette. Après solidification, ajouter la solution de tricaïne et passer à la loupe binoculaire qui sera utilisé plus tard pour imagerie time-lapse. <br /> Remarque: Cette étape peut également être réalisée en plaçant la larve anesthésié sur une boîte de Petri revêtue de 1,5% d'agarose dans du milieu d'embryon. Utilisez un stéréomicroscope avec le logiciel time-lapse. Sélectionnez un objectif et grossissement approprié, qui sera utilisé plus tard pour l'imagerie time-lapse. Ici, utiliser un 3,5 x 16 mm, distance de travail objectif sur un stéréomicroscope. Comme souhaité, utiliser les microscopes et autres lentilles de l'objectif, mais choisir un grossissement appropriée pour tenir compte de xy-dérive et la croissance de la nageoire potentiel durant la procédure d'imagerie. Sélectionnez le mode de détection de la caméra sur le microscope. Dans le logiciel, sélectionnez le mode 'live' pour voir la larve à l'écran. Ouvrez la fenêtre «Propriétés» pour détecter automatiquement la luminosité. Régler manuellement le contraste au microscope de base trans-illumination. Déplacez la larve sur le champ de vision et de sélectionner la fonction de correction d'ombrage pour minimiser fond pasISE. Placez la larve de nouveau dans le champ de vision et prendre un instantané. Enregistrez l'image. Retirer l'agarose de la larve d'abord gratter l'agarose de la tête. De cette façon, la larve peut être glissé hors de l'agarose en tirant doucement la tête loin de l'agarose restant avec une pointe de pipette microloader plafonné ou d'une goupille d'insectes. Avec une pipette Pasteur en verre transférer la larve dans la solution de tricaïne frais. 4. Amputation Assay Préparer une solution agarose à 1,5% en utilisant le milieu de l'embryon et versez une couche mince dans une boîte de Pétri. Laissez l'agarose solidifier. Sous un stéréomicroscope, placez le latéral de larve sur le agarose solidifié et amputer la nageoire caudale avec une aiguille 23 G de la seringue avec une légère pression (figure 3A). 5. Montage de la Larve pour imagerie time-lapse Procédez comme décrit dans les étapes 3.1 à 3.5 (figure 3B). <li> Transfert une baisse de 0,5 à 1,2% d'agarose liquide à 42 ° C contenant la larve dans l'anneau de chambre de l'imagerie (étape 2.1), orienter la larve et laissez l'agarose solidifier. Remplissez la bague avec une solution de tricaïne. Alternativement, si la chambre de boîte de Pétri (étape 2.2) est utilisé, la larve monter sur la lamelle de couvercle et remplir le couvercle avec une solution de tricaïne. Pour permettre une bonne cicatrisation ou la régénération des tissus de se produire, soigneusement gratter la gélose entourant la queue distale fin en utilisant une pointe de pipette microloader plafonné ou d'une goupille d'insectes. Essayez de ne pas nuire à la nageoire de façon répétée (figure 3C). Décanter la solution contenant le Tricaine retiré agarose et remplir l'anneau de chambre avec une solution de tricaïne frais. Appliquer de la graisse de silicium en haut de l'anneau de chambre et fixer une lame de verre de 25 mm x 75 mm. Essayez d'éviter les poches d'air dans la chambre, car ils vont interférer avec l'imagerie de fond clair et dessécher la larve au fil du temps. Si l'on utilise une boîte de Petri queune chambre de formation d'image, appliquer de la graisse de silicone sur le rebord supérieur du fond de chambre et remplir la chambre du bas avec une solution de tricaïne. Décanter avec soin la solution Tricaine dans le couvercle et retourner le couvercle d'immerger la larve dans la solution de tricaïne de la chambre inférieure à un léger angle pour éviter les poches d'air. La chambre sera scellé en raison de la graisse de silicium. 6. imagerie time-lapse Assembler une chambre d'incubation chauffée comme décrit dans 23,24 (Figure 4) .Positionner la chambre d'incubation dans le microscope et tourner sur la chaleur. Ajuster la température à 28 ° C pendant environ 10 à 20 min ou jusqu'à ce que la température se est stabilisée. Ouvrir l'avant de la chambre d'incubation chauffée et placer la chambre de formation d'image sur le support de microscope avec le couvre-face vers le haut vers l'objectif. Positionner l'ailette larvaire de manière à 2/3 du champ de vision reste inoccupé. Ceci assure la prise de lala croissance et la régénération de l'ailette au cours de la procédure d'imagerie sans avoir à repositionner la larve. Ajustez la larve montée à 28 ° C pendant ~ 30 min avant de commencer l'enregistrement time-lapse pour éviter les changements de l'intensité de fond clair ou des changements potentiels de l'agarose. Sinon, utiliser un tampon préchauffée à commencer imagerie après la réduction du temps de réglage. Pour configurer l'enregistrement time-lapse, ouvrir la fenêtre 6D multidimensionnelle Acquisition dans le logiciel de Axiovision et sélectionnez l'option z-stack et time-lapse. Facultatif) Dans l'onglet z-pile et mode Slice, sélectionnez l'épaisseur de la tranche et puis sélectionnez le mode Start / Stop. Définir la position supérieure et inférieure de la pile. Dans l'onglet time-lapse, sélectionnez l'intervalle et la durée du film et puis commencer le film en appuyant sur le bouton de démarrage. Nous avons constaté que des intervalles de 30 min sont suffisantes et cet intervalle ne génère pas de données excessive; Toutefois Shorteintervalles r peuvent être utilisés. Vérifiez la position et z-stack dimensions au cours de la première heure si la larve n'a pas été pré-réglée. Si nécessaire, repositionner la larve nouveau après une journée, que la larve a peut-être changé. Enregistrez le fichier à la fin de l'enregistrement time-lapse et procéder à la post-traitement et quantifications disponibles en utilisant le logiciel d'analyse d'image, tels que Imaris 25 ou l'open source des logiciels Image J 26 et 27 Fidji. 7. Analyse des données La détermination de la longueur de dérive. Ouvrez le film accéléré dans le logiciel d'imagerie et enregistrer les fichiers dans le format de fichier propriétaire pour améliorer les performances du logiciel. Sélectionnez la vue orthogonale à afficher différentes sections que les piles prévues. Pour la correction de la dérive, dans le menu Fidji, sélectionnez Plugins, puis l'enregistrement, et «la dérive 3D correcte '. Cela va ouvrir une fenêtre Fidji et effectuer les corrections de dérive. Correctla dérive de rotation dans la fonction Spots Imaris. Sinon, installer les plugins StackReg et TurboReg dans Image J et importer aux Fidji. Choisissez l'algorithme de transformation souhaitée dans le plugin StackReg. Pour mesurer les distances (par exemple, diamètre blesser ou longueur fin), sélectionnez l'option «ajouter de nouveaux points de mesure» dans la barre d'outils en haut à gauche. Sous «liste Configurer des Statistiques visibles valeurs 'dans le menu en bas à gauche, sélectionnez les valeurs statistiques à afficher. Dans le 'Mode Ligne »sous l'onglet Paramètres, sélectionnez« Paires (AB, CD …) ». Dans 'étiquettes Propriétés de sélectionner «Nom» et «Distance», pour afficher la distance entre les points A et B à côté de la ligne de mesure. Passez en mode 'Edition' et maintenez la touche Shift pour sélectionner le premier point à la fin de la notochorde. Ensuite, utilisez la même configuration pour sélectionner le deuxième point à la marge distale fin. Sous l'onglet «Statistiques», sélectionnez le bouton de disque (Exporter tous) en bas à droite pour afficher et exporter la distance dans l'image. Répéter les mesures à des moments sélectionnés en déplaçant le curseur sous l'image vers la droite. Au lieu de créer de nouveaux points de mesure, les précédents peuvent être repositionnés en sélectionnant d'abord le point avec le bouton gauche de la souris, puis en appuyant simultanément sur le décalage et le bouton gauche de la souris à la nouvelle position. Alternativement à l'option des points de mesure, utiliser le spectateur de tranche pour mesurer les distances. Dans le mode d'affichage de la tranche, faites défiler jusqu'à une position désirée et cliquez sur la première et la deuxième position avec le bouton gauche de la souris. La distance est affichée. Toutefois, cette option ne permet pas pour l'exportation de données. Déterminer la longueur des nageoires et zone dans ImageJ. Ouvrez le film time-lapse dans ImageJ utilisant un plugin qui reconnaît le format de fichier .zvi. Sinon, charger dans un QuickTime fichier ou une séquence de tiff. Remarque: Si vous utilisez un format de fichier TIFF non compressé, les dimensions de l'image ne ont pas besoin d'être spécifié. Si l'ouverture d'un format de fichier différent sans les informations de fichier, sélectionnez 'échelle Set' dans le menu 'Analyser' abord définir la distance d'image et l'unité. Dans le menu 'échelle Set', tapez le 'Distance en pixels », ci-dessous genre dans la distance connue' pour la valeur de pixel (ce qui peut être obtenu en mesurant le nombre de pixels sur une barre d'échelle qui a été ajoutée à l'image , puis cliquez sur Mesurer pour obtenir le résultat), et le «Unité de longueur" (typiquement «um»). Puis cliquez sur OK. Pour les mesures de la nageoire sélectionnez l'outil "Sélection Freehand 'dans la barre d'outils et décrivent les ailettes en maintenant le bouton gauche de la souris tout en tirant le long du contour de la nageoire. Pour les mesures de longueur de nageoire, sélectionnez l'outil en ligne «droite» et de tracer une ligne entre les points désirés êtremesuré. Cliquez sur l'option 'Mesure' sous 'Analyser' pour afficher la zone et de la longueur de la nageoire. Répétez cette étape aussi souvent que nécessaire pour les points de temps multiples du film. Utilisation de logiciel de statistiques, les données peuvent être représentées graphiquement.