Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Zebravis (parelmoer stam) werden gefokt en opgegroeid volgens vastgestelde protocollen. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren, met behulp van 0,4 mM tricaïne voor anesthesie en 1 mM tricaïne voor euthanasie. Zebravis embryo's en larven werden in strikte overeenstemming met goede dierenpraktijk behandeld zoals goedgekeurd door de bevoegde commissie (MDI Biological Laboratory dier kern IACUC nummer 13-20). Deze studie werd goedgekeurd door de National Human Genome Research Institute Animal Care en gebruik Comite, MDIBL Institutionele Assurance # A-3562-01 onder protocol # 14-09. Opmerking: De beeldopname die fin regeneratie larvale zebravis wordt samengevat in de volgende stappen vangt: 1. Verhoging van de zebravis te larvale stadia Het verzamelen van de eieren en zet ongeveer 50 eieren in een 100 x 25 mm petrischaal met 0,03% Instant Ocean zout in gedeïoniseerd water aangevuld met 0,00004% methyleenblauw. Incubeer O / N in een 28,5 ° C incubator. <li> De volgende ochtend verwijder de dode embryo's met een glazen pipet en spoel de eieren in een zeef met 0,03% Instant Ocean zout in gedemineraliseerd water (genoemd embryo gemiddeld). Opmerking: Medium zoals Ringers 18 Hanks 18, E2 19, E3 20 en Danieau 21 mei voorkeur. sup> Voeg verse embryo medium om de schotel. Bij gebruik van gepigmenteerde stammen, eventueel toevoegen van 0,2 mM 1-fenyl-2-thioureum (PTU), zoals PTU melanogenese en daarmee pigmentatie van de larven te voorkomen. Laat de embryo's verder te ontwikkelen in de couveuse tot 2 dagen na de bevruchting of andere gewenste larvale stadium. 2. Voorbereiding van de Imaging Kamer Methode 1: Imaging raakvlakken gemaakt van PVC of Teflon buis (figuur 1) Opmerking: Deze methode is vergelijkbaar met Concha en Adams (1998) 22. Verwerven drinkwater grade plastic of Teflon slang van een hardware-winkel met een 25 mm buitenste eenda 20 mm binnendiameter. Snij de buis ringen van ongeveer 10 mm dik maken met een vlak oppervlak aan elke zijde. Gebruik> 200 korrel schuurpapier om de randen glad. Maak de ringen met warm water en 70% ethanol en laat ze drogen. Met een pipetpunt toepassing siliconenvet de helft van een ring en bevestig de ring op een 75 mm x 25 mm dekglaasje. U kunt ook gebruik maken van een 3 ml injectiespuit gevuld met siliconen vet in plaats van een pipet tip. Opmerking: Omdat het moeilijk is om het siliconenvet voegen in de spuit 3 ml, voeg het siliconenvet een 30 ml spuit eerste en deze voor het vullen van de spuit 3 ml. Methode 2: Bereiding van een petrischaal als imaging kamer. Verwerven 35 of 60 mm petrischalen met een glazen dekglaasje aan het deksel (Figuur 2A). Alternatief, zoals getoond in figuur 3 van Distel & Koester (2007) 23, boor een opening klein genoeg houd een dekglaasje in het deksel van een kleine petrischaal en siliconenvet van toepassing op de buitenkant met een spuit 3 ml. Met behulp van een schone pipetpunt voorzichtig voeg een ronde of vierkante dekglaasje van gewenste dikte naar buiten (Figuur 2B). Om de agarose worden gebruikt voor het monteren blijft stevig vastzitten in de beeldvormingsprocedure, voeg een boete plastic gaas in de ring. Eerst snijd de mazen van vensterscherm verkregen uit een ijzer, in de omvang van de binnenring diameter met fijne schaar met een hoek. Snijd een kleine rechthoek> tweemaal de grootte van de larve in het midden van de maas (figuur 1, 2). Breng vier kleine puntjes van niet-toxisch siliconenvet aan het grensvlak tussen het dekglaasje en de kamer ring (Figuur 1A). Tang om het gaas stevig aan de onderkant van de glazen dekglaasje. 3. Montage en beeldvorming van de Pre-injreerd Larve (Deze stap is optioneel) Opmerking: Deze stap is geschikt voor vergelijkingen tussen de geamputeerde en geregenereerd vin lengte, als de amputatie vliegtuig na fin regeneratie is niet herkenbaar in de zebravis larven. Bereid een 0,5-1,2% laag smeltpunt agarose-oplossing in embryo medium voor immobilisatie van het monster. Verwarm de agarose in een magnetron en breng de oplossing agarose in 1,5 ml buizen die zijn voorverwarmd tot 42 ° C in een verwarmingsblok. Laat de hete agarose afkoelen tot 42 ° C, die kan worden gehandhaafd gedurende enkele weken bij deze temperatuur. Vermijd pipetteren de larven in agarose boven 42 ° C, aangezien daardoor het dier zal zijn. Verdoven verscheidene larven met 10 ml 0,4 mM tricaïne (pH 7) in embryo medium in een 60 mm petrischaal. Bereid de tricaïne volgens de zebravis Book Recepten 18. Alternatief gebruik 10 ml van een 1: 1000 verdunning van 99% 2-fenoxyethanol in een 60 mm petrischaal. Poke de larven met een bedekte microloader pipettip hun aanslagreactie alvorens verder te gaan beoordelen. Gebruik alleen niet-responsief larven. Transfer één larve in de 42 ° C agarose-oplossing met behulp van een glas Pasteur pipet. Oefen geen overmatige vloeistof niet overdragen naar de agarose, anders wordt de agarose zal ook worden verdund en niet stollen. Gooi de resterende vloeistof uit de pipet en breng de larve met één druppel agarose in een kleine petrischaal (35 of 60 mm diameter). Plaats de larve op zijn kant voor de beeldvorming van de staartvin. Laat de agarose stollen. Beoordeel de agarose met een plastic pipet tip; de tip zal onderdompelen in de agarose als het te vloeibaar. Zodra de agarose gestold is, zal een kleine inkeping zichtbaar na het aanraken met een pipet tip. Naar aanleiding van het stollen, voeg tricaïne oplossing en ga verder met de stereomicroscoop die later zal worden gebruikt voor time-lapse imaging. <br /> Opmerking: Deze stap kan ook worden uitgevoerd door het plaatsen van het verdoofde larve op een petrischaal bekleed met 1,5% agarose in embryo medium. Gebruik een stereomicroscoop met time-lapse-software. Selecteer een geschikte objectieve en vergroting, die later zal worden gebruikt voor time-lapse imaging. Hier, gebruik dan een 3,5 x 16 mm werkafstand objectief op een stereomicroscoop. Naar wens gebruik alternatieve microscopen en objectieven maar kies juiste vergroting verantwoorden mogelijke xy-drift en groei van de vin in de beeldvormingsprocedure. Selecteer de camera detectie functie op de microscoop. In de software, selecteert u de 'live' modus om de larve op het scherm te bekijken. Open het venster 'Eigenschappen' om de helderheid automatisch te detecteren. Handmatig aanpassen van het contrast bij de microscoop trans-verlichting basis. Beweeg de larve uit het gezichtsveld en selecteer de Shading Correction functie op de achtergrond geen minimaliserenise. Plaats de larve terug in het gezichtsveld en een momentopname. Sla de afbeelding. Verwijder de agarose uit de larve door eerst te schrapen de agarose het hoofd af. Op deze manier de larve kan uit de agarose worden geschoven door zachtjes te trekken het hoofd weg van de resterende agarose met een bedekte microloader pipet tip of een insect pin. Met een glas Pasteur pipet overdracht van de larve in de frisse tricaïne oplossing. 4. Amputatie Assay Bereid een 1,5% agarose-oplossing met embryo medium en giet een dunne laag in een petrischaal. Laat de agarose stollen. Onder een stereomicroscoop, plaatst de larve zijwaarts op de gestolde agarose en amputeren de staartvin met een 23 G naald van de spuit met lichte druk (figuur 3A). 5. Montage van de Larve voor Time-lapse Imaging Ga te werk zoals beschreven in de stappen 3,1-3,5 (Figuur 3B). <li> Breng een druppel van 0,5-1,2% vloeibare agarose bij 42 ° C met de larve in de beeldvorming kamer ring (stap 2.1), oriënteren de larve en laat de agarose stollen. Vul de ring met tricaïne oplossing. Als alternatief, als de petrischaal kamer (stap 2.2) wordt gebruikt, monteer de larve op het deksel dekglaasje en vul het deksel met tricaïne oplossing. Voor een goede wondgenezing of weefselregeneratie te laten plaatsvinden, voorzichtig afschrapen de agarose rond de distale staartvin met een bedekte microloader pipettip of een insect pin. Probeer niet om de vin herhaaldelijk (Figuur 3C) verwonden. Schenk de tricaïne oplossing met agarose het verwijderd en vul de kamer ring met verse tricaïne oplossing. Toepassing siliconenvet aan de bovenkant van de kamer ring uit en plaats een 75 mm x 25 mm glasplaatje. Probeer om luchtzakken te voorkomen dat in de kamer, want zij zullen interfereren met helderveld imaging en uitdrogen van de larve in de tijd. Bij gebruik van een petrischaal alseen imaging kamer, gelden siliconenvet aan de bovenrand van de onderste kamer en vul de onderste kamer met tricaïne oplossing. Decanteren voorzichtig de tricaïne oplossing in het deksel en draai de deksel op de larve dompelen in de tricaïne oplossing van de onderste kamer onder een kleine hoek met luchtzakken te voorkomen. De kamer wordt verzegeld door het siliconenvet. 6. Time-lapse Imaging Monteer een verwarmde incubatiekamer zoals beschreven in 23,24 (figuur 4) .Plaats de incubatiekamer rond de microscoop en zet het vuur. Breng de temperatuur op 28 ° C gedurende 10-20 minuten of totdat de temperatuur gestabiliseerd. Open de voorkant van de verhitte incubatiekamer en plaats de beeldvorming kamer op de microscoop stand met het dekglaasje naar boven naar het doel. Plaats de larvale vin op een manier die 2/3 van het gezichtsveld blijft onbezet. Dit zorgt voor de vangst van degroei en regeneratie van de vin in de loop van de beeldvormende procedure zonder de larve verplaatsen. Pas de gemonteerde larve tot 28 ° C ~ 30 minuten voor aanvang van de time-lapse-opname op veranderingen in helderveld intensiteit of mogelijke verschuivingen van de agar te voorkomen. Als alternatief gebruik maken voorverwarmde buffer om beeldvorming start na kortere aanpassingstijd. Voor het instellen van de time-lapse-opname, open de 6D Multidimensional Acquisition raam in de AxioVision software en selecteer de optie z-stack en time-lapse. Optioneel) In het tabblad z-stack en Slice-modus, selecteert u de slice dikte en vervolgens selecteert u de Start / Stop-modus. Definieer de bovenste en onderste positie van de stapel. In het tabblad time-lapse, selecteert u het interval en de duur van de film en start de film door het indrukken van de startknop. We vonden dat 30 min intervallen zijn voldoende en dit interval niet overmatig gegevens te produceren; echter ShorteR intervallen worden gebruikt. Controleer de positie en z-stack afmetingen tijdens het eerste uur als de larve niet vooraf ingesteld. Indien nodig, de positie van de larve weer na een dag, als de larve kan zijn verschoven. Sla het bestand op het einde van de time-lapse-opname en verder te gaan met de post-processing en kwantificering met behulp van beschikbare software voor beeldanalyse, zoals Imaris 25 of de open source softwarepakketten Image J 26 en Fiji 27. 7. Data Analyse Het bepalen van de vin lengte. Open de time-lapse film in de imaging-software en de bestanden opslaan in het eigen bestandsformaat om software te verbeteren. Selecteer de orthogonale oog op individuele secties als geprojecteerd stapels weer te geven. Voor drift correctie, selecteert Plugins, dan Registratie, en 'Correct 3D drift' onder de Fiji-menu. Dit zal een Fiji-venster openen en de drift correcties. Juistrotatie-drift in de Imaris Spots functie. Als alternatief, installeer de StackReg en TurboReg plugins in Afbeelding J en importeren naar Fiji. Kies de gewenste transformatie algoritme in de StackReg plugin. Om afstanden (bv wond diameter of vin lengte) te meten, selecteer de optie 'Add New Meetpunten' in de linker werkbalk. Onder 'lijst configureren van zichtbare Statistieken Waarden' in de linker menu de statistieken waarden moeten worden weergegeven. In de 'Lijn Mode' onder het tabblad instellingen selecteren 'Pairs (AB, CD, …)'. In 'Labels Eigenschappen' select 'Naam' en 'Afstand', om de afstand tussen de punten A en B naast de meting lijn weer te geven. Schakelen naar de modus 'Edit' en houd de shift-toets om het eerste punt aan het einde van de notochord selecteren. Maak dan gebruik van dezelfde configuratie om het tweede punt aan het distale fin marge te selecteren. Selecteer op het tabblad 'Statistieken' de schijf knop (Alles exporteren) in de rechter benedenhoek te geven en te exporteren de afstand in het beeld. Herhaal de metingen op geselecteerde tijdstippen door de schuifregelaar onder de afbeelding aan de rechterkant. In plaats van het creëren van nieuwe Meetpunten, kan de vorige verplaatst worden door eerst het punt te selecteren met de linker muisknop, dan gelijktijdig indrukken van de shift en de linker muisknop op de nieuwe positie. Als alternatief voor de optie Meetpunten, gebruik maken van de slice kijker om afstanden te meten. In de slice uitzicht modus, ga naar een gewenste positie en klik op de eerste en tweede positie met de linker muisknop. De afstand wordt weergegeven. Deze optie is echter niet mogelijk voor data-export. Het bepalen van fin lengte en omgeving in ImageJ. Open de time-lapse film in ImageJ met behulp van een plugin die het .zvi bestandsformaat herkent. Als alternatief, laden in een QuickTime bestand of tiff volgorde. Opmerking: Als u een niet-gecomprimeerde TIFF-bestandsformaat, weet de afmetingen van het beeld niet te worden opgegeven. Als het openen van een ander bestandsformaat, zonder het bestand informatie, selecteer 'Set Scale' onder het menu 'Analyseren' om eerst de afbeelding afstand en eenheid te definiëren. In de 'Set Schaal menu', typt u het 'Afstand in pixels', hieronder het type in de 'bekende afstand' voor de pixel waarde (dit kan worden verkregen door het meten van het aantal pixels op een schaal bar die werd toegevoegd aan het beeld Klik vervolgens op Meet om het resultaat te verkrijgen), en de 'Eenheid van lengte' (typisch 'um'). Klik vervolgens op OK. Voor fin gebied metingen selecteer de 'Selectie uit vrije hand' gereedschap in de werkbalk en een overzicht van de vin gebied door de linkermuisknop ingedrukt te houden tijdens het tekenen langs de omtrek van de vin. Voor vin lengte metingen, selecteer de 'Straight' line tool en trek een lijn tussen de gewenste punten te zijngemeten. Klik op de 'Measure' optie onder 'Analyseren' naar het gebied en de lengte van de vin weer te geven. Herhaal deze stap zo vaak als nodig is voor verschillende tijdstippen van de film. Met behulp van statistische software kunnen de gegevens grafisch worden weergegeven.